康復1號對小鼠成骨細胞增殖的影響

趙德春吳紹長邢葆平李曉一

1浙江省武義縣婦幼保健院 武義 322300 2浙江省麗水市第二人民醫院 3浙江省立同德醫院

康復1號對小鼠成骨細胞增殖的影響

趙德春1吳紹長2邢葆平3李曉一3

1浙江省武義縣婦幼保健院 武義 322300 2浙江省麗水市第二人民醫院 3浙江省立同德醫院

目的觀察康復1號提取物對小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞增殖的影響。方法將稀釋成不同梯度濃度的康復1號提取物和成骨樣細胞MC3T3-E1共同體外培養，采用MTT法檢測細胞的增殖。結果康復1號提取物低濃度組（1:2000）對MC3T3-E1細胞增殖無影響（P＞0.05）；中濃度組（1:1000）對細胞增殖影響明顯，增殖率48.1%（P＜0.05）；高濃度組（1:250）增殖率68.1%（P＜0.01）。結論體外實驗表明，康復1號能明顯促進小鼠MC3T3-E1細胞的增殖。

小鼠；骨質疏松癥；MC3T3-E1細胞；康復1號

骨質疏松是由多種原因引起的一種全身性骨骼疾病。目前我國骨質疏松患者8400萬人，占總人口的6.6%[1]。成骨細胞是骨質形成過程中的重要細胞，在預防骨質疏松中起重要作用。康復1號是本院的協定處方，由煅龍骨、煅牡蠣、熟地黃、淮山藥、茯苓、淫羊藿、骨碎補等中藥組成。多年臨床應用顯示，康復1號對骨質疏松有較好的療效。本研究以小鼠成骨細胞MC3T3-E1為細胞模型，通過體外實驗的方法，觀察康復1號提取液對成骨細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材 料 中藥材由浙江中醫藥大學飲片廠提供；5.3-（4，5）-二甲基-2-噻唑-（2，5）-苯基溴化四氮唑鹽（MTT）粉劑購于美國Sigma公司；0.25胰酶消化液和細胞培養基（DMEM培養基）購于美國GIBCO公司；PAA胎牛血清購于上海微科生物有限公司。細胞株及細胞培養MC3T3-E1細胞由浙江大學傳染病研究所提供。

1.2方 法

1.2.1藥物制備 各味藥材按處方劑量（煅龍骨、煅牡蠣各24g，熟地黃、淮山藥、茯苓各9g，淫羊藿12g，骨碎補9g等）配伍后搗碎過20目篩，取100g加水回流提取3次（1h/次），濃縮配成相當于生藥材大約1g/mL的儲備液，經0.45um微膜過濾、除菌，置4℃保存備用。實驗時用無血清DMEM依次按梯度稀釋成終濃度為1:250、1:1000、1:2000。

1.2.2實驗方法 以Mosmann建立的MTT比色法[2]，檢測細胞增殖。將成骨樣細胞MC3T3-E1接種于培養瓶中，置于5%CO2分壓、飽和濕度、37℃的細胞培養箱中進行培養傳代。待傳代至第3代時，取其生長旺盛的MC3T3-E1成骨樣細胞，將成骨樣細胞加入到4%胎牛血清成骨樣細胞培養基中，配制成濃度為5×104個/mL的懸液，再接種于成骨樣細胞培養板，貼壁生長24h后加入不同梯度濃度的康復1號提取物，每個濃度4個復孔。于37℃，5%二氧化碳培養箱48h后，每孔加入30μL MTT溶液（2mg/mL），繼續培養4h，吸凈上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩5～15min，使MTT還原產物結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀測定每孔光密度殖（A值），波長定于570nm。測得等體積的細胞孔的吸光值為對照，將不同濃度的加藥組與對照組進行比較，細胞增殖率計算公式：增殖率=（實驗組-對照組）/對照組× 100%

1.3統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統計分析，計量資料用（） 表示，采用單因素方差分析，各組間增殖率比較采用卡方檢驗。

2 結果

康復1號提取物和MC3T3-E1細胞共孵育48h后，低濃度組（1:2000）對細胞增殖無影響（P＞0.05）；中濃度組（1:1000）對細胞增殖影響明顯，增殖率48.1%（P＜0.05）；高濃度組（1:250）增殖率68.1%（P＜0.01）。隨著藥物濃度的增加，對MC3T3-E1細胞增殖的影響也明顯加大，各劑量組兩兩比較，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表1、圖1。

表1 康復1號提取物對MC3T3-E1細胞增殖的影響（）

表1 康復1號提取物對MC3T3-E1細胞增殖的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

?

圖1 各濃度康復1號提取物共孵育后MC3T3-E1細胞生長圖

3 討論

骨質疏松癥是以骨質量丟失以及骨組織退變為特征的骨代謝疾病，成骨細胞在骨重建過程中具有重要作用[2]。MC3T3-E1細胞株是日本學者KODAMA等在1981年從新生C57BL/6小鼠顱蓋骨中分離培養建株的成骨細胞株。該細胞株具有體外培養成骨細胞的各種生物學特性，包括堿性磷酸酶（ALP）活性、I型膠原合成和基質鈣化等成骨細胞的生物學特性，常作為骨代謝研究的細胞模型[4]。

中醫認為，腎主骨、生髓藏精，為先天之本，腎精的盛衰對骨骼的生長代謝有密切關系。腎精足則骨髓之生化有源，骨髓充，骨骼得到髓的充分滋養則骨骼堅。腎精虧，骨髓生化不足，髓腔空虛而不能營養骨骼，腎虛精髓不充，骨失所養為其主要病機。根據“腎主骨”理論，應用仙茅配伍加減補腎陽，強筋骨，對骨質疏松癥有較好的治療效果，其中淫羊藿具有增強骨形成和降低骨吸收的雙重作用。骨碎補總黃酮能明顯提高去卵巢大鼠骨密度，同時具有調整血清IL-4、IL-6、TNF-α水平的作用，IL-6、TNF-α等細胞因子能夠促進破骨細胞（OC）的骨吸收。骨碎補提取物還能抑制OC性骨吸收[5-6]。

本實驗結果表明，康復1號能明顯促進MC3T3-E1成骨細胞增殖，在不同的藥物濃度的作用下對成骨細胞的增殖有明顯變化及影響。可增強成骨細胞活性,加速成骨細胞的增殖與分化，使骨量增加，從而明顯促進骨修復和骨形成，這可能是康復1號治療骨質疏松癥的部分機制。

［1］詹前進.骨質疏松的診斷與治療之進展［J］.醫療保健器具，2001，（2）：183-188.

［2］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J ImmunolMethods，1983，65（1-2）：55-63.

［3］孟繁浩，熊志立，陶勝宇，等.成骨細胞的生物學特征及其調控活性物質［J］.化學與生物工程，2005，（11）：8-10.

［4］Kodama H，Amagai Y，Sudo S，et al.Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria［J］. Jpn J Oral Biol，1981，23（4）：899-901.

［5］姜向沖，劉敏如.補腎復方膠囊含藥血清對成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響［J］.成都中醫藥大學學報，2009，（01）：46-50.

［6］于海濤，鞠成國，章琦，等.狗脊生、制品不同提取部位對成骨細胞的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（24）：36-39.

Effect of Herb Rehabilitation No.1 on Mouse Osteoblast Proliferation

ZHAO Dechun1,WU Shaochang2,XING Baoping3,LI Xiaoyi. 1 Zhejiang wuyi maternity care,Wuyi (322300),China;2 The Second People's Hospital of Lishui City;3 Tongde Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo observe the effect of rehabilitation No.1 herb extracts on the proliferation of MC3T3-E1 cells.MethodsOsteoblast-like MC3T3-E1 cells were cultured in vitro with different concentrations of herb extracts of rehabilitation No.1.Cell proliferation was detected by using MTT method.ResultsLow concentration group（1:2000）of the rehabilitation No.1 herb extract had no effect on the proliferation of MC3T3-E1 cells;the proliferation rate was 48.1%in middle concentration group（1:1000）（P＜0.05）;and the proliferation rate of high concentration group（1:250）was 68.1%（P＜0.01）.ConclusionRrehabilitation No.1 herb extracts can promote the proliferation of MC3T3-E1 cells in vitro.

mice；osteoporosis；MC3T3-E1 cells；rehabilitation No.1 herb extracts

2013-09-24

修回日期：2013-10-20

浙江省中醫藥科學研究基金項目（No.2012ZB004）；浙江省醫藥衛生平臺重點資助計劃（No.2012ZDA007）；浙江省醫學衛生科學研究基金項目（No.2010KYB133）

李曉一，E-mail：2001life@163.com