大黃素治療裸鼠胰腺癌肝轉移瘤的實驗研究

徐賢綢溫培楠王兆洪劉 岸楊偉青

1浙江省平陽縣人民醫院普外科 平陽 325400 2溫州醫科大學附屬第二醫院腫瘤外科

大黃素治療裸鼠胰腺癌肝轉移瘤的實驗研究

徐賢綢1溫培楠1王兆洪2劉 岸2楊偉青1

1浙江省平陽縣人民醫院普外科 平陽 325400 2溫州醫科大學附屬第二醫院腫瘤外科

目的觀察大黃素及其脂質體對裸鼠胰腺癌肝轉移模型影響及作用機制。方法建立裸鼠胰腺癌肝轉移模型，隨機分為對照組、吉西他濱組、實驗Ⅰ組、實驗Ⅱ組和實驗Ⅲ組，每組10只，分別經脾臟注射給予10%葡萄糖、吉西他濱100mg/kg、大黃素10mg/kg、大黃素脂質體5mg/kg和大黃素脂質體10mg/kg。觀察各組荷瘤裸鼠肝轉移瘤生長情況，免疫組織化學法檢測腫瘤組織Ki-67和CD-34表達，Tunel法檢測腫瘤組織細胞凋亡，Western blotting法檢測腫瘤組織MMP-2和MMP-9表達水平。結果與對照組比較，吉西他濱組、實驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組肝轉移瘤生長明顯抑制（P均＜0.05）；與實驗Ⅰ、Ⅱ組比較，實驗Ⅲ組腫瘤縮小更明顯（P＜0.05）；實驗Ⅲ組瘤重與吉西他濱組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；實驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤組織Ki-67、CD34、MMP-2和MMP-9表達較對照組均明顯降低（P均＜0.05），而凋亡細胞明顯增加（P均＜0.05）。結論大黃素及其脂質體均有抗裸鼠胰腺癌肝轉移瘤的作用，但后者作用更為明顯，其機制可能與抑制胰腺癌組織MMP-2和MMP-9表達有關。

小鼠；胰腺腫瘤；腫瘤轉移；大黃素；脂質體

胰腺癌為消化道惡性腫瘤，多數患者確診時因已合并肝等部位轉移而失去手術機會，吉西他濱作為治療胰腺癌的首選化療藥物，其治療有效率也不高，同時存在一定毒副反應[1-2]。因此，有必要尋求一種低毒高效的藥物以控制胰腺癌及肝轉移瘤的生長，改善進展期胰腺癌患者預后。筆者采用薄膜-超聲分散法制備大黃素脂質體，以吉西他濱作為陽性對照，觀察大黃素及其脂質體治療裸鼠胰腺癌肝轉移瘤的效果，并初步探討其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1動物和細胞株 4～6周齡雌性BALB/c-nu/nu品系裸小鼠，無特定病原體（SPF）級，體質量（18.56± 0.85)g，購自中科院上海動物實驗中心，動物質量合格證號：SCXK（滬）2007-0005，飼養于溫州醫學院動物實驗中心SPF屏障系統內，動物飼料和水等經嚴格滅菌處理。人胰腺癌細胞株SW1990購自ATCC，細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，含1%的青-鏈霉素，在5%CO2和37℃培養箱內孵育，胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞為實驗對象。

1.2藥物和試劑 大黃素購自美國Sigma公司，采用薄膜-超聲分散法[3]制備大黃素脂質體，大黃素納米脂質體為淺黃色透明膠體，在電鏡下呈完整圓球形或橢圓形的球粒，粒徑約為25nm，含量為（2.1± 0.2）mg/mL，包封率為（98.26±0.38）%；胎牛血清、含EDTA胰酶和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；Ki-67和CD34抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；ABC免疫組化檢測試劑盒購自美國Gibco公司；TUNEL試劑盒購自瑞士羅氏公司；MMP-2、MMP-9和β-actin抗體購自美國Epitomics公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3模型建立和給藥 裸鼠胰腺癌皮下移植瘤制備：取2×106個指數生長期的SW1990細胞注射至裸鼠左下肢外側皮下組織，3周后待皮下移植瘤生長成1cm3后取出，將腫瘤組織剪成1mm3的組織塊備用。裸鼠胰腺癌肝轉移模型制備：取1mm3的瘤塊，置于16#帶針芯穿刺針內，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，行上腹正中切口約1cm，暴露肝左葉，刺入穿刺針，將瘤塊種植于裸鼠肝左葉，縫合裸鼠腹壁。共制備50只裸鼠胰腺癌肝轉移模型，并隨機分成5組，每組10只。對照組每只給予10%葡萄糖0.1mL；吉西他濱組給予吉西他濱100mg/kg；實驗Ⅰ組給予大黃素10mg/kg；實驗Ⅱ組給予大黃素脂質體5mg/ kg；實驗Ⅲ組給予大黃素脂質體10mg/kg。手術后第4天開始通過皮試針頭經脾下極注射給藥，術后第3周處死裸鼠，完整剝取肝臟腫瘤組織，稱重并計算抑瘤率。抑瘤率=（1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%

1.4腫瘤組織Ki-67和CD34測定 采用免疫組織化學法檢測。按照Envision法的操作步驟進行免疫組化實驗，每組選取5個標本經正常羊血清封閉非特異性抗原，加入一抗孵育過夜后，加入生物素標記的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，脫水后封片。低倍鏡（×100）下隨機選擇20個視野，圖片結果用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析Ki-67和CD34的陽性表達強度。

1.5腫瘤組織細胞凋亡 采用Tunel法檢測。按Tunel試劑盒說明書操作，細胞核固縮、染色體凝集成塊、呈棕褐色染色者為凋亡細胞，低倍鏡（100×）下觀察20個視野，圖片結果用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進行分析。

1.6腫瘤組織蛋白表達的檢測 采用Western blot法檢測。將腫瘤組織粉碎后加入RIPA裂解液裂解細胞，提取上清液。用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（20μg/孔），常規8%SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（1: 1000）于4℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1:2500）室溫孵育1h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.7統計學方法 實驗所得計量數據以均數±標準差（） 表示，應用SPSS11.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1大黃素對裸鼠胰腺癌肝轉移瘤生長的影響 各組裸鼠死亡情況：實驗中對照組、實驗Ⅱ組和實驗Ⅲ組裸鼠進食良好，無死亡；吉西他濱組裸鼠出現惡病質2只，死亡1只；實驗Ⅰ組裸鼠出現稀便3只，死亡1只。各組裸鼠移植瘤重量及抑瘤率：實驗結束后處死模型裸鼠后分離肝臟腫瘤并稱重，各組裸鼠肝臟移植瘤重見表1。與對照組比較，吉西他濱組、實驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組瘤重均明顯減輕（P＜0.05），抑瘤率分別為79.2%、50.6%、59.3%和77.9%；實驗Ⅲ組分別與實驗Ⅰ、Ⅱ組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）；吉西他濱組與實驗Ⅲ組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組腫瘤組織病理學檢測結果：各組裸鼠肝臟腫瘤組織經HE染色后鏡下觀察均證實為胰腺癌，其中吉西他濱組和實驗Ⅰ組腫瘤組織中可見組織細胞片狀壞死，見圖1（封四）。

表1 各組裸鼠瘤重、抑瘤率比較（）

表1 各組裸鼠瘤重、抑瘤率比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與實驗Ⅰ、Ⅱ組比較，△P＜0.05

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2.2大黃素脂質體對裸鼠胰腺癌肝轉移瘤組織Ki-67和CD34表達的影響 Ki-67染色陽性細胞表現為胞漿不著色，胞核染成棕褐色，核固縮，染色質濃聚，而CD34陽性細胞表現為胞膜為棕褐色。免疫組化結果顯示，實驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組裸鼠腫瘤組織Ki-67和CD34陽性表達強度均明顯低于對照組（P＜0.05）；吉西他濱組Ki-67陽性表達較對照組下降（P＜0.05），而CD34陽性表達與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與實驗Ⅰ組比較，實驗Ⅲ組Ki-67和CD34陽性表達強度明顯降低（P＜0.05），見表2，圖2（封四）。

表2 各組裸鼠腫瘤組織細胞Ki-67、CD34和TunelIOD值比較（）

表2 各組裸鼠腫瘤組織細胞Ki-67、CD34和TunelIOD值比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與實驗Ⅲ組比較，▲P＜0.05

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2.3大黃素脂質體對裸鼠胰腺癌肝轉移瘤細胞凋亡的影響 Tunel染色陽性細胞表現為僅為胞核染成棕褐色。實驗各組腫瘤組織切片中均可見凋亡細胞，吉西他濱組、實驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組裸鼠腫瘤組織Tunel陽性細胞的IOD值較對照組均明顯升高（P均＜0.05）；實驗Ⅲ組Tunel陽性細胞的IOD值顯著高于實驗Ⅰ組（P＜0.05）。見表2，圖3（封四）。

表3 各組裸鼠腫瘤組織細胞MMP-2和MMP-9 IOD值比較（）

表3 各組裸鼠腫瘤組織細胞MMP-2和MMP-9 IOD值比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與實驗Ⅲ組比較，△P＜0.05

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2.4大黃素脂質體對裸鼠胰腺癌肝轉移瘤細胞MMP-2、MMP-9表達的影響 Western印跡檢測結果表明，MMP-2、MMP-9和β-actin陽性特異性條帶分別為72kDa、79kDa和43kDa；大黃素或大黃素脂質體作用裸鼠胰腺癌肝轉移瘤模型后，均可抑制MMP-2和MMP-9在腫瘤組織細胞中的表達（P＜0.05），但吉西他濱組MMP-2和MMP-9表達強度與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與實驗Ⅰ、Ⅱ組比較，實驗Ⅲ組MMP-2和MMP-9蛋白表達強度明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3，圖4（封四）。

3 討 論

大黃素是一種蒽醌類化合物，是大黃等中藥的有效成分，對包括胰腺癌在內的多種惡性腫瘤生長有抑制作用，且對機體毒副作用少[4-6]。而脂質體作為一種藥物載體，因可避免藥物被內皮細胞攝取而直接送入病灶并緩慢發揮作用，故可使所載藥物生物利用率增高、不良反應減輕[7-8]，實驗研究和臨床應用均顯示較好的應用前景。大黃素因具有強親脂性，制作成脂質體的大黃素水溶性大大增加，可具良好的生理相容性[3]。因此，我們的研究力求證實大黃素對裸鼠胰腺癌肝轉移瘤的治療作用以及脂質體作為大黃素載體的“減毒增效”作用，并初步探討其可能的機制。

本研究結果表明，吉西他濱（100mg/kg）可明顯抑制裸鼠胰腺癌肝轉移瘤生長，而10mg/kg脂質體大黃素也有較明顯的抑瘤作用，二者效果相當，證實脂質體大黃素抑制胰腺癌肝轉移瘤生長的療效。實驗結果還表明，普通大黃素也可抑制胰腺癌肝轉移瘤生長，但劑量為10mg/kg的大黃素的抑瘤率為50.6%，低于劑量為10mg/kg脂質體大黃素的抑瘤效果，也低于劑量為5mg/kg脂質體大黃素的抗腫瘤效應，表明將大黃素制作成脂質體給藥可增強其抗癌效應。對腫瘤組織進行免疫組化分析可知，脂質體大黃素可明顯降低Ki-67在腫瘤組織中的陽性表達，表明脂質體大黃素能有效聚集于轉移瘤上，增加局部藥物濃度從而增強大黃素的抑瘤效應。因此，本研究證實了大黃素對胰腺癌肝轉移瘤的作用，也證實了脂質體作為載體提高大黃素的抑瘤效果。

既往研究表明，大黃素抑制腫瘤細胞生長方式以誘導細胞凋亡為主，而非通過明顯的細胞毒性作用[9]。本研究過程中也可觀察到細胞毒性藥物吉西他濱作用裸鼠后出現稀便和食欲不振等明顯毒副作用，普通大黃素組裸鼠也有類似反應，但較輕。而大黃素脂質體作用實驗動物后無一例出現明顯毒副作用，同時鏡下觀察大黃素脂質體作用后腫瘤組織未見明顯組織壞死表現，表明脂質體作為載體可降低所載藥物（本實驗為大黃素）的毒性，與文獻報道相符[7-8]。

腫瘤轉移的機制比較公認的是三步驟學說[6]，即①分離：腫瘤細胞黏附能力下降，脫離原發病灶；②降解：癌細胞和局部宿主細胞分泌水解酶，水解細胞外基質（ECM）和基底膜中的蛋白成分；③移動：癌細胞通過水解后形成的組織間隙向周圍浸潤或進入淋巴管、血管，向遠處轉移。三個步驟涉及癌細胞與癌細胞，癌細胞與ECM，癌細胞與宿主細胞間的復雜的相互作用。癌細胞可產生和誘導間質細胞產生多種蛋白酶降解ECM，促進浸潤轉移，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是其中最為重要的一組。MMP-2和MMP-9在過度表達情況下能夠破壞基底膜和降解細胞外基質中膠原和非膠原成分，使得腫瘤突破原發部位正常基底膜并向深層浸潤，且突破血管和淋巴管，造成腫瘤血行和淋巴轉移。同時MMP-9還可調控血管內皮生長因子（VEGF）[10]，促進腫瘤血管生成。

因此，抑制MMP-2和MMP-9能有效抑制惡性腫瘤浸潤、轉移和血管生長。在本實驗中，吉西他濱對腫瘤血管生長以及對MMP-2和MMP-9表達無明顯影響（P＞0.05），而大黃素脂質體不僅可有效抑制肝轉移瘤組織CD-34的表達，還可抑制MMP-2和MMP-9在體內腫瘤中表達（P＜0.05），且較相同濃度大黃素明顯，表明大黃素脂質體可能通過抑制MMP-2和MMP-9在胰腺癌組織表達，而有效抑制胰腺癌肝轉移瘤生長。

綜上所述，大黃素脂質體因具脂質體藥物的生物利用率高和不良反應輕的優勢，在對裸鼠胰腺癌肝轉移瘤模型進行治療中取得比普通大黃素更好、與吉西他濱相當的療效，但毒副作用較后兩者明顯減少，其抗腫瘤作用機制可能與抑制腫瘤細胞中MMP-2和MMP-9表達有關。

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Inhibitory Effect of Emodin on Hepatic Metastasis of Human Pancreatic Carcinoma in Nude Mice

XU Xianchou1,WEN Peinan1,WANG Zhaohong2,LIU An,YANG Weiqing.1 Department of General Surgery,the People's Hospital of Pinguang,Pingyang(325400),China;2 Department of Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of free emodin and liposome emodin on hepatic metastasis of human pancreatic carcinoma in nude mice.MethodsAfter the model of hepatic metastasis of human pancreatic carcinoma was established in mice,the mice were randomized into 5 groups（n=10）,receiving 10%glucose, gemcitabine（100 mg/kg）,free emodin（10 mg/kg）,and liposomal emodin（5 and 10 mg/kg）via spleen injection in each group.The hepatic metastatic foci of pancreatic tumor weight and inhibition rate were evaluated after the mice were sacrificed.Immunohistochemistry（IHC）was used to detect the positive expression of Ki-67 and CD34 in tumors.The Tunel test kit was used to explore cellular apoptosis in tumor tissue.Expression of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blotting.ResultsAdministration of gemcitabine,liposomal emodin and free emodin significantly decreased tumor weight as compared to untreated controls（P＜0.05）;administration of liposomal emodin resulted in a substantial delay of tumor growth as compared to free emodin at the same dose（P＜0.05）,but did not result in a significant difference as compared to gemcitabine group（P＞0.05）.The positive expression of Ki-67 and CD34 in the tumors of liposomal emodin groups were significantly lower than those in control group（P＜0.05）.Apoptosis occurred more frequently in liposomal emodin group than in control group（P＜0.05）.ConclusionEmodin has the anti-tumor effect on hepatic metastasis of pancreatic tumor and the effect is more obvious in liposomal emodin than in free emodin.The underlying mechanism may partially be through down-regulation of MMP-2 and MMP-9.

mice；pancreatic neoplasm；neoplasm metastasis；emodin；liposomes

2013-10-10

浙江省溫州市科技計劃項目（No.Y20110012）

徐賢綢，E-mail：xxc@pyhosp.com