芍藥甘草湯對哮喘大鼠STAT 6與IL-13水平的影響

董 雷蔡宛如朱詩乒

1浙江省新華醫院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中醫院呼吸科

·論 著·

芍藥甘草湯對哮喘大鼠STAT 6與IL-13水平的影響

董 雷1蔡宛如1朱詩乒2

1浙江省新華醫院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中醫院呼吸科

目的觀察芍藥甘草湯對哮喘大鼠信號傳導和轉錄激活因子6（STAT 6）與白介素-13（IL-13）水平的干預作用，探討其防治支氣管哮喘的作用機制。方法60只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組（NULL組）、模型組（OVA組）、地塞米松組（DXM組）及芍藥甘草湯高（SG10組）、中（SG5組）、低（SG2.5組）劑量組，每組10只。除正常對照組外均行支氣管哮喘造模，相應藥物灌胃。檢測各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞和嗜酸性粒細胞計數，免疫組化法測肺組織中STAT 6蛋白表達，ELISA法檢測血漿中IL-13含量。結果與NULL組比較，OVA組哮喘大鼠肺泡灌洗液（BALF）中白細胞總數、嗜酸性粒細胞計數及氣道上皮STAT 6表達和血漿IL-13水平均明顯升高（P＜0.01）。DXM組及各劑量芍藥甘草湯組BALF中白細胞總數和嗜酸性粒細胞計數、氣道上皮STAT 6表達和血漿IL-13水平較OVA組降低（P＜0.01），但仍高于NULL組（P＜0.01）。結論芍藥甘草湯防治大鼠支氣管哮喘的作用機制可能與抑制哮喘大鼠肺組織STAT 6表達，降低血漿IL-13水平，降低哮喘大鼠BALF中白細胞總數及嗜酸性粒細胞計數有關。

大鼠；哮喘；芍藥甘草湯；信號傳導和轉錄激活因子6；白介素-13

支氣管哮喘是一種由多種因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征的免疫變態反應性疾病。芍藥甘草湯系張仲景《傷寒論》中的著名方劑，主要由芍藥和甘草二味中藥等量組成，藥理研究證實，芍藥甘草湯具有明顯的解痙、鎮痛、抗炎等作用[1]。近十幾年來，單用此方或隨癥加減治療哮喘、頑咳和小兒百日咳療效十分顯著[2]。本研究旨在探討芍藥甘草湯治療哮喘的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性清潔級SD大鼠60只，體質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：2011A032。

1.2試劑與藥物 卵白蛋白（Sigma公司）；氫氧化鋁干粉（廣州化學試劑廠，批號961201-2）；地塞米松片（浙江仙居制藥股份有限公司）；IL-13 ELISA試劑盒（ADL公司，批號070633）；免疫大鼠STAT6多克隆抗體（晶美公司）；芍藥甘草湯（芍藥、甘草等分組成，藥材由浙江省中醫院中藥房提供，濃煎成每毫升含1g生藥）；

1.3實驗儀器 M304020壓縮霧化機（德國百瑞公司），OLYMPUS BX50顯微攝像系統（日本OLYMPUS公司）。

1.4動物分組及模型建立 60只SD大鼠隨機分為正常對照組（NULL組）、模型組（OVA組）、地塞米松組（DXM組）、芍藥甘草湯高劑量組（SG10組）、芍藥甘草湯中劑量組（SG5組）、芍藥甘草湯低劑量組（SG2.5組），每組10只。除正常對照組之外，其余各組均進行支氣管哮喘造模[3]。造模方法：第1、7、14天分別給予雞卵白蛋白（OVA）抗原液1mL（含OVA 10mg，氫氧化鋁凝膠20mg，滅活百日咳桿菌5×109個）腹腔注射，1天1次，第21天開始給予1%OVA溶液霧化吸入，1天1次，每次30min，連續3天。以大鼠出現呼吸急促，點頭呼吸，甚則四肢末端紫紺為造模成功的標志。正常對照組：第1、7、14天分別給予生理鹽水1mL腹腔注射，第21天開始給予生理鹽水超聲霧化吸入，1天1次，每次30min，連續3天。

1.5給藥方法 每次霧化前30min，NULL組、OVA組予生理鹽水10mL/kg體質量灌胃；DXM組予DXM 1mg/kg灌胃；SG10組、SG5組、SG2.5組予芍藥甘草湯10g/kg、5g/kg、2.5g/kg灌胃。

1.6標本采集和處理 各組均于首次霧化后5d采集和處理標本。每組大鼠均予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取血制備血漿，右肺肺泡灌洗，左肺留取病理。

1.7檢測指標及方法

1.7.1支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞總數和嗜酸性粒細胞計數測定 取血完畢后大鼠行氣管插管至右肺并結扎，用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次3mL，反復灌洗3次，回收率均大于50%，取0.1mLBALF在顯微鏡下用血細胞計數板計算白細胞總數，然后將BALF離心10min（1000rpm），離心沉淀后細胞團重懸于1mLPBS（磷酸鹽緩沖溶液）中，取0.2mL圖片，瑞吉染液染色，至少計數400個細胞做細胞分類，再計算嗜酸性粒細胞數目。

1.7.2血漿IL-13測定 各組大鼠經3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，剖腹，分離腹主動脈取血，37℃水浴15min，3000r/min離心20min，取上部血清，保存于-20℃冰箱中。用ELISA法測定血清IL-13。

1.7.3氣道上皮STAT 6蛋白檢測 肺組織切片后用免疫組化法進行測定。光學顯微鏡下觀察5個完整的氣道橫切面免疫組化圖像，氣道上皮細胞STAT 6陽性表達表現為胞漿和/或胞核黃色染色，對圖像進行攝影，利用圖像分析儀對圖像進行分析，計算STAT 6蛋白的陽性表達單位（PU，positive unit）。

1.8統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，數據以均數±標準差（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組BALF中白細胞總數及嗜酸性粒細胞計數比較 OVA組BALF中白細胞總數及嗜酸性粒細胞計數較NULL組明顯升高（P＜0.01）；DXM組和各劑量芍藥甘草湯組白細胞總數和嗜酸性粒細胞計數較OVA組減少（P＜0.01），但高于NULL組（P＜0.01）；SG2.5組白細胞總數和嗜酸性粒細胞計數高于DXM組和其他劑量SG組（P＜0.05）；DXM組與SG10、SG5組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2各組血漿IL-13含量比較 OVA組血漿IL-13含量較NULL組升高（P＜0.01）；DXM組和各劑量芍藥甘草湯組血漿IL-13較OVA組減少（P＜0.01）；DXM組IL-13含量低于不同劑量SG組（P＜0.05）；SG10、SG5、SG2.5組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠BALF中白細胞總數及嗜酸性粒細胞計數比較（） ×107/L

表1 各組大鼠BALF中白細胞總數及嗜酸性粒細胞計數比較（） ×107/L

注：與NULL組比較，*P＜0.01；與OVA組比較，▲P＜0.01；與SG2.5組比較，△P＜0.05

?

表2 各組大鼠血漿IL-13比較（）pg/mL

表2 各組大鼠血漿IL-13比較（）pg/mL

注：與NULL組比較，*P＜0.01；與OVA組比較，▲P＜0.01；與DXM組比較，☆P＜0.05

?

2.3 各組大鼠氣道上皮STAT 6蛋白表達 OVA組氣道上皮STAT 6陽性細胞表達量明顯高于NULL組（P＜0.01）；DXM組和不同劑量SG組陽性細胞表達量明顯低于OVA組（P＜0.01）；DXM組和SG10、SG5組STAT6的陽性細胞表達量低于SG2.5組（P＜0.05）；DXM組與SG10、SG5組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠氣道上皮STAT6蛋白表達（）pg/mL

表3 各組大鼠氣道上皮STAT6蛋白表達（）pg/mL

注：與NULL組比較，*P＜0.01；與OVA組比較，▲P＜0.01；與SG2.5組比較，△P＜0.05

?

3 討論

支氣管哮喘是一種氣道慢性變應性炎癥性疾病,多種炎性細胞參與哮喘發病過程，目前認為嗜酸性粒細胞是哮喘氣道炎癥的主要效應細胞，大多數炎性細胞最終通過EOS產生效應[4]。IL-13是一種主要由活化的Th2細胞分泌的多效能細胞因子，可刺激細胞的增殖和合成，通過與肥大細胞、嗜酸性粒細胞的作用而誘發哮喘的急性發作。近年研究表明，IL-13可不依賴于IL-4、IgE及嗜酸粒細胞等傳統途徑而誘發哮喘的所有癥狀，因此，IL-13被認為是哮喘發病中極為重要的一種介質[5]。STAT 6是一種能被眾多細胞外多肽類分子激活、參與基因轉錄調控的信號轉導和轉錄激活因子，它通過JAK-STAT信號轉導途徑介導細胞因子IL-4、IL-13等的生物學活性。Akimoto等[6]研究發現，STAT 6基因缺陷小鼠（STAT 6-/-）吸入卵蛋白致敏后，肺泡灌洗液中未發現EOS浸潤，肺組織、支氣管黏膜、支氣管周圍組織未見炎癥反應，氣道反應性試驗未見氣道反應性增高。研究表明，STAT 6通過調節Th2優勢應答促進B淋巴細胞增殖與分化、參與IgE的同種型轉換，在支氣管哮喘病理生理過程中起重要作用。

研究表明，芍藥的主要成分芍藥總苷是一種雙向抗炎免疫調節藥，而甘草的主要成分甘草次酸有明顯的皮質激素樣作用。Takagi[7]實驗表明，甘草次酸抑制炎癥反應的效價為氫化可的松的1/10。熊谷朗報道，甘草次酸能抑制IgE和組胺的合成從而發揮抗炎、抗過敏作用，而且芍藥總苷和甘草次酸具有協同作用[8]。

本研究表明，芍藥甘草湯可明顯抑制哮喘大鼠的氣道黏膜炎癥和EOS浸潤，同時降低IL-13水平和氣道上皮STAT6表達，說明芍藥甘草湯治療哮喘的作用可能通過上述機制實現。

［1］曹艷，旺建偉，段淑香，等.芍藥甘草湯臨床及藥理研究近況［J］.中醫藥信息，2006，23（3）：41-43.

［2］鄭繼生，錢景莉.芍藥甘草湯及其臨床運用［J］.河南中醫，2012，32（8）：966-968.

［3］王洋，關煒，李韶妮.芍藥甘草湯防治支氣管哮喘機理研究［J］.山西中醫，2011，27（9）：43-45.

［4］Lampinen M，Hakansson L，Venge P.Interleukin-2 inhibit eosinophil migration but is counteracted by IL-5 priming［1］.Clin Exp Allergy，2001，31（2）：249-258.

［5］Wills-Karp M，Luyimbazi J，Xu X，et al.Interleukin-13：central mediator of allergic asthma［J］.Science，1998，282（3597）：2258-2261.

［6］Akimoto T，Numata F，Tamura M，et al.Abrogation of bronchia Eosinophilic inflammation and airway hyperreactivity in signal transducers and activators of transcription（STAT）b-deficient mice［J］.J Exp Med，1998，187（9）：1537-1542.

［7］Takagi.Study of Glycyrrhiza uralensis［J］.International journal of Oriental Medicine 1989，14（4）：185.

［8］中國醫科院藥物研究所等.中藥志［M］.北京：人民衛生出社，1993：183-184.

Effects of Shaoyaogancaotang on STAT6 and Interleukin-13 in Asthmatic Rats

Dong Lei1，CAI Wanru1，ZHU Shiping2. 1 Department of Respiratory Diseases,Xinhua Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310005),China；2 Department of Respiratory Diseases，Hangzhou Chinese Medical Hospital.

ObjectiveTo observe the effect of Shaoyaogancaotang（SG）on signal transducer and activator of transcription 6（STAT6）and interleukin-13 in asthmatic rat,and to explore the possible mechanism of SG to asthma.MethodsSixty SD rats were randomly divided into 6 groups:normal group（group NULL）,asthmatic group（group OVA）,dexamethasone group（group DXM）,group SG10,group SG5,and group SG2.5.Before nebulization,group NULL and OVA was given saline of 10ml/kg intragastrically,group DXM was given DXM of 1 mg/kg,and groups SG were given SG of 10,5,and 2.5 g/kg,respectively.The numbers of total leukocytes and eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were measured by light microscope.The protein expression of STAT6 in airway epithelium was shown by immunohistochemistry.The serum IL-13 were detected by ELISA.ResultsAfter sensitized and challenged,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF of OVA-treated rats significantly in creased compared with group NULL（P＜0.01）.After treatment with different dosages of SG and dexamethasone,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF,the STAT6 protein expression,and serum IL-13 were significantly lower than those in group OVA（P＜0.01）,but higher than those in group NULL（P＜0.01）.ConclusionShaoyaogancaotang can significantly inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,decrease the IL-SG can inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,and decrease the serum IL-13 and the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF.SG might be of potential value in protection and treatment of asthma.

asthma；Shaoyaogancaotang；signal transducer and activator of transcription 6；interleukin-13

2013-09-20

浙江省中醫藥優秀青年人才基金計劃（No.2012ZQ013）