頸椎后縱韌帶骨化癥與BMP-2、BMP-4基因多態性的關聯性研究

周 耀魏 威陳春悅葉 楊

1浙江省奉化市中醫醫院 奉化 315500 2浙江省中西醫結合醫院

頸椎后縱韌帶骨化癥與BMP-2、BMP-4基因多態性的關聯性研究

周 耀1魏 威2陳春悅2葉 楊2

1浙江省奉化市中醫醫院 奉化 315500 2浙江省中西醫結合醫院

目的探討頸椎后縱韌帶骨化癥（OPLL）與BMP-2基因第3外顯子的rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607兩個SNP位點的相關性。方法選取47例浙江地區漢族頸椎后縱韌帶骨化癥患者，以100名正常個體作為對照組，采用PCR+Sanger DNA測序，統計分析2個位點基因型的分布信息。結果BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者、BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現明顯差異（P＜0.05，P＜0.01）。結論BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因、第4外顯子的rs147822607A→C，這2個多態性位點與OPLL的發病具有強烈相關性。

頸椎后縱韌帶骨化癥；單核苷酸多態性；易感基因；BMP-2基因；BMP-4基因

頸椎后縱韌帶骨化癥（ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL）屬于一種骨成形病，表現為頸椎后縱韌帶內異位骨的形成，主要壓迫脊髓產生臨床癥狀以及病理損害。OPLL為一種遺傳因素和環境因素共同作用所致的復雜疾病（多基因疾病）[1-6]，高發于日本人以及亞洲人。通過檢索國內外相關文獻，我們選取2個可疑的OPLL易感基因多態性SNP位點，BMP-2基因第 3外顯子的 rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607，進行多態性分析，以期獲得這2個多態性位點與浙江地區漢族OPLL患者發病之間的關聯性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2010年7月—2013年9月就診于浙江省奉化市中醫院、浙江省中西醫結合醫院、解放軍一一七醫院等骨科的漢族OPLL患者47例，男30例，女17例，平均年齡（45.4±11.2）歲，病程0.3～8年，平均（4.1±1.2）年。根據頸部CT或者MRI明確診斷[7]。患者籍貫均在浙江地區。同時，以100名無血緣關系的浙江地區漢族正常個體作為對照組，男50名，女50名，平均年齡（43.1±7.3）歲。每位參與者均簽署書面知情同意書。

1.2方 法 ①DNA制備：入組者均在無菌環境下抽取外周血10mL（EDTA抗凝）。用外周血DNA純化試劑盒（德國Qiagen公司）提取和純化基因組DNA。②PCR引物的合成：參考NCBI等人類基因組SNP數據庫，用Primer Premier 5.0軟件設計2個基因SNP位點的PCR引物序列。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。③DNA測序分型對各多態性SNP位點分別進行PCR擴增，通過Sanger DNA測序進行基因分型。PCR產物的DNA測序委托上海生工生物工程公司進行。根據基因分型結果，計算基因型頻率和等位基因頻率。

1.3統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，采用χ2檢驗，P＜0.05，表示具有統計學意義。

2 結 果

2個多態性SNP位點的基因型分布經χ2檢驗，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡[8]。BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現明顯差異（P＜0.05）。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現明顯差異（P＜0.01）。各等位基因在患者組與正常對照組中的分布和分析結果，見表2。

表2 兩組rs79417223和rs147822607分布及比較 例

3 討論

OPLL是一種高發于日本人以及亞洲人的常見病。日本人的發病率約為1.9%～4.3%，韓國人約為3.6%，我國臺灣省約為2.8%，我國北方人群的OPLL發病率約為0.44%～8.92%，而北美白人僅為0.12%[1-3]。OPLL是引起脊髓病的重要原因，大部分可保持長期穩定狀態，起病隱匿，進展緩慢，呈現惡性發展趨勢，可引起脊髓不可逆性損害，其中部分患者的脊髓功能出現急劇惡化[1]。OPLL的致癱風險顯著高于其他頸椎退行性疾病，其原因包括缺乏有效的早期篩選方法和診斷方法，自然史不明，無法確定手術時機，術后骨化物持續生長等。目前，臨床上尚無有效的方法延緩和改善OPLL的骨化過程，手術療法仍然是最主要的治療手段，但風險系數較高[1]。1989年，Terayama等發現，日本OPLL家系中先證者親屬的發病率顯著高于普通人群[4]。在北美OPLL患者中，盡管大部分病例為散發性，但仍可見部分病例具有家族聚集性[5]。目前已經達成共識，OPLL是一種嚴重危害人體健康的復雜性多基因遺傳病，其發病機制不詳，迄今沒有可靠的生物學識別指標[1-2]。許多學者已做了大量的醫學研究來揭示OPLL發病的分子醫學基礎[9]。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）為多功能蛋白，具有獨特的骨形成作用和其他形態發生過程。BMP-2基因定位于20p12，而BMP-4基因位于14q22-q23。Kawaguchi等[10]曾發現某例OPLL患者術后標本中的BMP-2僅表達于骨質化的基質、軟骨細胞以及鄰近OPLL軟骨的成纖維細胞中，而不在未骨質化的頸椎后縱韌帶中表達。Kon等[11]對從OPLL和非OPLL患者的脊柱韌帶中分離到的成纖維細胞進行體外培養后，也發現BMP-2優先誘導OPLL患者的成纖維細胞的成骨分化。Wang等[12]對192例漢族OPLL患者和304名健康對照的研究表明，具有BMP-2基因第3外顯子SNP TC和CC基因型的男性更易罹患OPLL。Karasugi等[2]最新的一項對214例日本OPLL患病同胞對的大規模全基因組連鎖分析研究顯示，OPLL最有可能的易感基因區域位于20p12的微衛星標記D20S894附近（NPL= 3.43，P=0.000，27）。而Furushima等[13]對126例日本OPLL患病同胞對進行了的大規模候選基因篩查發現，僅BMP-4基因與OPLL顯著關聯（NPL=2.230，P=0.035）。本研究分別選取了BMP-2第3外顯子的rs79417223和BMP-4第4外顯子的rs147822607兩個SNP位點進行分析，研究結果發現BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現明顯差異（P＜0.05）。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現明顯差異（P＜0.01）。本研究提示BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因第4外顯子的rs147822607A→C，這2個多態性位點與OPLL的發病具有強烈相關性。

由于取材等方面的原因，目前直接在人頸椎后縱韌帶組織細胞水平上探討OPLL的易感基因表達水平還比較困難，加之該病呈復雜性多基因遺傳方式，并表現出強烈的遺傳異質性和表型異質性，因而尚無法準確地確定致病基因，并闡釋易感基因的基因-基因、基因-環境之間的相互作用及其在OPLL發病中的地位[1-3，9]。因此，對大樣本患者群體進行可疑易感基因的SNP分型，尋找和鑒定相關的致病基因，是切實可行的研究方法之一。由于受時間、地點限制，本研究只收集到了47例浙江地區漢族OPLL患者，選擇了2個基因多態性SNP位點進行了初步研究。研究結果提示此位點與OPLL的發病具有強烈相關性。但本研究的患者均來自于中國浙江地區，而且研究的樣本數又相對偏小，所以研究結果與以前文獻報道可能會存在有一些差異。在今后的研究中，可以將樣本再擴大化，并且運用目前先進的外顯子捕獲二代測序技術運用于OPLL基因外顯子組水平的分析研究，以獲得OPLL發生的分子遺傳學基礎[9]。

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Relationship Between the Gene Polymorphisms of BMP-2 and BMP-4 with Ossification of Posterior Longitudinal Ligament of the Spine in a Chinese population

ZHOU Yao1,WEI Wei2,CHEN Chunyue2,YE Yang2. 1 Fenghua Chinese Medical Hospital of Zhejiang Province,Fenghua(315500),China;2 Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo explore the relationship between 2 single nucleotide polymorphisms（SNPs）of BMP-2 and BMP-4 and ossification of posterior longitudinal ligament of the spine（OPLL）in a Chinese population.MethodsForty-seven sporadic OPLL patients and 100 healthy controls in Zhejiang area were recruited for association analysis.The SNP regions of BMP-2 and BMP-4 genes were amplified by PCR and Sanger sequencing.Genotype frequencies of the SNPs were compared between the cases and control subjects with SPSS 13.0 software.ResultsBoth Of the rs79417223 G→A site in the exon 3 of BMP-2 and the rs147822607 A→C site in the exon 4 of BMP-4，the patient and normal control groups showed significant differences（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionsThe rs79417223 and rs147822607 have a strong correlation to OPLL.

ossification of posterior longitudinal ligament；single nucleotide polymorphism；susceptibility gene；BMP-2 gene；BMP-4 gene

2013-12-01

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（No.2010KY168），浙江省寧波市科技計劃項目（No.2013C50023）

葉楊，E-mail：dagou1234@163.com