甲醛溶液對雞大腸桿菌滅活效果的影響

于國營等

摘要：為了優化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進行了比較，同時選用不同生產廠家的甲醛溶液進行了滅活比較試驗。結果表明，對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，采用37 ℃攪拌滅活，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，用滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應就越大。不同生產廠家的甲醛溶液滅活效果無明顯差異。

關鍵詞：甲醛溶液；雞大腸桿菌；滅活工藝

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）02-0010-03

甲醛溶液是目前滅活疫苗生產中應用最廣泛的滅活劑，成熟的滅活工藝能夠保證研制工作的順利開展和細菌滅活疫苗的生物安全。為了優化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進行了比較，同時也對不同廠家生產的甲醛溶液進行了滅活比較試驗。

1 材料

1.1 大腸桿菌菌種

O1株、O2株、O78株均由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.2 培養基

LB液體培養基。

1.3 菌液

分別制備O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

1.4 試驗雞

21～28日齡SPF雞均購自北京某SPF雞場。

1.5 滅活劑

上海國藥集團化學試劑有限公司生產的甲醛，批號為2011304。濟南魯康化學工業有限公司生產的甲醛，批號為110713。

2 試驗設計

2.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

分別量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分別按終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分別加入上海國藥生產的化學純甲醛溶液，分別置于37 ℃滅活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液滅活后，均用LB肉湯培養基2支，各接種0.2ml，37 ℃培養7 d，觀察有無細菌生長，以確定菌液滅活是否徹底。

2.2 疫苗的安全檢驗

取“2.1”經0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液滅活徹底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐溫并混勻后作為水相，再與油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分別用21～28日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d有無因注射疫苗引起的不良反應。

2.3 滅活劑的比較

在201101批菌液經滅活和安全試驗的基礎上，使用不同廠家（上海國藥、濟南魯康）生產的甲醛溶液，按照“2.1”項選定的滅活條件，分別對201102批O1株、O2株、O78株菌液進行滅活試驗，觀察不同廠家生產的甲醛溶液的滅活效果有無差異。

3 結果與分析

3.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

試驗結果（表1）表明，各株菌液在37 ℃條件下，甲醛溶液最終濃度為0.1%攪拌滅活36 h滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.2%攪拌滅活24 h滅活徹底，甲醛最終濃度為0.3%攪拌滅活16 h均能滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.4%攪拌滅活12 h滅活徹底。

3.2 滅活的安全檢驗

試驗結果（表2）表明，用終濃度為0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗進行安全檢驗，試驗雞均未出現注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應；用終濃度為0.4%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗，安檢雞3/10均出現精神一過性不振，2/10飲食略有下降，3/10注射部位發紅。

3.3 滅活劑的比較

試驗結果（表3）表明，上海國藥、濟南魯康生產的甲醛溶液按0.3%終濃度分別加入到201102批各株菌液，37 ℃攪拌滅活16 h，均滅活徹底。兩廠家生產的同級另甲醛溶液對雞大腸桿菌的滅活效果無明顯差異。

4 小結與討論

本研究用甲醛終濃度為0.1%、0.2%、0.3%滅活的菌液制備疫苗進行安全檢驗，安檢雞均未出現注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應；用甲醛終濃度為0.4%滅活徹底的菌液制備疫苗，安檢雞3/10精神一過性不振，安檢雞2/10飲食略有下降，3/10注射部位均發紅。對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應就越大。

將雞大腸桿菌菌液，按終濃度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃攪拌滅活16 h，滅活徹底，且疫苗安檢后未見不良反應?？紤]實際生產中影響因素較多，為了保證滅活徹底，同時為減少高濃度甲醛副反應，建議采用甲醛溶液，按0.3%的終濃度在37 ℃條件下攪拌滅活24 h作為實際生產中雞大腸桿菌（O1株、O2株、O78株）菌液的滅活條件。

不同廠家生產的甲醛溶液質量基本一致，無明顯差異。由于實際生產中，菌液量較大，為防止由于濃度過高引起局部的蛋白凝聚和變性，因此建議將甲醛溶液進行稀釋后使用。

本試驗結果是在實驗室小量操作等條件下得出的試驗結果，在具體研究或生產其他菌株大腸桿菌或其他種類細菌時，其滅活工藝還需要另外進行具體地摸索和驗證。盡管如此，依然希望本試驗所得出的數據和結論能對相關研究提供一定意義的參考。

參考文獻：

[1] 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學[CM3].北京：中國農業出版社，2002.857-862.

[2] 才學鵬，景志忠，邱昌慶.動物疫苗學[M].北京：中國農業科學技術出版社，2009.317.

[3] 吳清民.動物傳染病學[M].北京：中國農業大學出版社，2002.514-518.

[4] 馮靜蘭.中華人民共和國獸用生物制品規程[M].北京：化學工業出版社，2000，75-76.

摘要：為了優化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進行了比較，同時選用不同生產廠家的甲醛溶液進行了滅活比較試驗。結果表明，對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，采用37 ℃攪拌滅活，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，用滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應就越大。不同生產廠家的甲醛溶液滅活效果無明顯差異。

關鍵詞：甲醛溶液；雞大腸桿菌；滅活工藝

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）02-0010-03

甲醛溶液是目前滅活疫苗生產中應用最廣泛的滅活劑，成熟的滅活工藝能夠保證研制工作的順利開展和細菌滅活疫苗的生物安全。為了優化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進行了比較，同時也對不同廠家生產的甲醛溶液進行了滅活比較試驗。

1 材料

1.1 大腸桿菌菌種

O1株、O2株、O78株均由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.2 培養基

LB液體培養基。

1.3 菌液

分別制備O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

1.4 試驗雞

21～28日齡SPF雞均購自北京某SPF雞場。

1.5 滅活劑

上海國藥集團化學試劑有限公司生產的甲醛，批號為2011304。濟南魯康化學工業有限公司生產的甲醛，批號為110713。

2 試驗設計

2.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

分別量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分別按終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分別加入上海國藥生產的化學純甲醛溶液，分別置于37 ℃滅活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液滅活后，均用LB肉湯培養基2支，各接種0.2ml，37 ℃培養7 d，觀察有無細菌生長，以確定菌液滅活是否徹底。

2.2 疫苗的安全檢驗

取“2.1”經0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液滅活徹底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐溫并混勻后作為水相，再與油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分別用21～28日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d有無因注射疫苗引起的不良反應。

2.3 滅活劑的比較

在201101批菌液經滅活和安全試驗的基礎上，使用不同廠家（上海國藥、濟南魯康）生產的甲醛溶液，按照“2.1”項選定的滅活條件，分別對201102批O1株、O2株、O78株菌液進行滅活試驗，觀察不同廠家生產的甲醛溶液的滅活效果有無差異。

3 結果與分析

3.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

試驗結果（表1）表明，各株菌液在37 ℃條件下，甲醛溶液最終濃度為0.1%攪拌滅活36 h滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.2%攪拌滅活24 h滅活徹底，甲醛最終濃度為0.3%攪拌滅活16 h均能滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.4%攪拌滅活12 h滅活徹底。

3.2 滅活的安全檢驗

試驗結果（表2）表明，用終濃度為0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗進行安全檢驗，試驗雞均未出現注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應；用終濃度為0.4%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗，安檢雞3/10均出現精神一過性不振，2/10飲食略有下降，3/10注射部位發紅。

3.3 滅活劑的比較

試驗結果（表3）表明，上海國藥、濟南魯康生產的甲醛溶液按0.3%終濃度分別加入到201102批各株菌液，37 ℃攪拌滅活16 h，均滅活徹底。兩廠家生產的同級另甲醛溶液對雞大腸桿菌的滅活效果無明顯差異。

4 小結與討論

本研究用甲醛終濃度為0.1%、0.2%、0.3%滅活的菌液制備疫苗進行安全檢驗，安檢雞均未出現注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應；用甲醛終濃度為0.4%滅活徹底的菌液制備疫苗，安檢雞3/10精神一過性不振，安檢雞2/10飲食略有下降，3/10注射部位均發紅。對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應就越大。

將雞大腸桿菌菌液，按終濃度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃攪拌滅活16 h，滅活徹底，且疫苗安檢后未見不良反應?？紤]實際生產中影響因素較多，為了保證滅活徹底，同時為減少高濃度甲醛副反應，建議采用甲醛溶液，按0.3%的終濃度在37 ℃條件下攪拌滅活24 h作為實際生產中雞大腸桿菌（O1株、O2株、O78株）菌液的滅活條件。

不同廠家生產的甲醛溶液質量基本一致，無明顯差異。由于實際生產中，菌液量較大，為防止由于濃度過高引起局部的蛋白凝聚和變性，因此建議將甲醛溶液進行稀釋后使用。

本試驗結果是在實驗室小量操作等條件下得出的試驗結果，在具體研究或生產其他菌株大腸桿菌或其他種類細菌時，其滅活工藝還需要另外進行具體地摸索和驗證。盡管如此，依然希望本試驗所得出的數據和結論能對相關研究提供一定意義的參考。

參考文獻：

[1] 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學[CM3].北京：中國農業出版社，2002.857-862.

[2] 才學鵬，景志忠，邱昌慶.動物疫苗學[M].北京：中國農業科學技術出版社，2009.317.

[3] 吳清民.動物傳染病學[M].北京：中國農業大學出版社，2002.514-518.

[4] 馮靜蘭.中華人民共和國獸用生物制品規程[M].北京：化學工業出版社，2000，75-76.

摘要：為了優化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進行了比較，同時選用不同生產廠家的甲醛溶液進行了滅活比較試驗。結果表明，對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，采用37 ℃攪拌滅活，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，用滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應就越大。不同生產廠家的甲醛溶液滅活效果無明顯差異。

關鍵詞：甲醛溶液；雞大腸桿菌；滅活工藝

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）02-0010-03

甲醛溶液是目前滅活疫苗生產中應用最廣泛的滅活劑，成熟的滅活工藝能夠保證研制工作的順利開展和細菌滅活疫苗的生物安全。為了優化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進行了比較，同時也對不同廠家生產的甲醛溶液進行了滅活比較試驗。

1 材料

1.1 大腸桿菌菌種

O1株、O2株、O78株均由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.2 培養基

LB液體培養基。

1.3 菌液

分別制備O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

1.4 試驗雞

21～28日齡SPF雞均購自北京某SPF雞場。

1.5 滅活劑

上海國藥集團化學試劑有限公司生產的甲醛，批號為2011304。濟南魯康化學工業有限公司生產的甲醛，批號為110713。

2 試驗設計

2.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

分別量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分別按終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分別加入上海國藥生產的化學純甲醛溶液，分別置于37 ℃滅活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液滅活后，均用LB肉湯培養基2支，各接種0.2ml，37 ℃培養7 d，觀察有無細菌生長，以確定菌液滅活是否徹底。

2.2 疫苗的安全檢驗

取“2.1”經0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液滅活徹底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐溫并混勻后作為水相，再與油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分別用21～28日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d有無因注射疫苗引起的不良反應。

2.3 滅活劑的比較

在201101批菌液經滅活和安全試驗的基礎上，使用不同廠家（上海國藥、濟南魯康）生產的甲醛溶液，按照“2.1”項選定的滅活條件，分別對201102批O1株、O2株、O78株菌液進行滅活試驗，觀察不同廠家生產的甲醛溶液的滅活效果有無差異。

3 結果與分析

3.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

試驗結果（表1）表明，各株菌液在37 ℃條件下，甲醛溶液最終濃度為0.1%攪拌滅活36 h滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.2%攪拌滅活24 h滅活徹底，甲醛最終濃度為0.3%攪拌滅活16 h均能滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.4%攪拌滅活12 h滅活徹底。

3.2 滅活的安全檢驗

試驗結果（表2）表明，用終濃度為0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗進行安全檢驗，試驗雞均未出現注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應；用終濃度為0.4%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗，安檢雞3/10均出現精神一過性不振，2/10飲食略有下降，3/10注射部位發紅。

3.3 滅活劑的比較

試驗結果（表3）表明，上海國藥、濟南魯康生產的甲醛溶液按0.3%終濃度分別加入到201102批各株菌液，37 ℃攪拌滅活16 h，均滅活徹底。兩廠家生產的同級另甲醛溶液對雞大腸桿菌的滅活效果無明顯差異。

4 小結與討論

本研究用甲醛終濃度為0.1%、0.2%、0.3%滅活的菌液制備疫苗進行安全檢驗，安檢雞均未出現注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應；用甲醛終濃度為0.4%滅活徹底的菌液制備疫苗，安檢雞3/10精神一過性不振，安檢雞2/10飲食略有下降，3/10注射部位均發紅。對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應就越大。

將雞大腸桿菌菌液，按終濃度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃攪拌滅活16 h，滅活徹底，且疫苗安檢后未見不良反應?？紤]實際生產中影響因素較多，為了保證滅活徹底，同時為減少高濃度甲醛副反應，建議采用甲醛溶液，按0.3%的終濃度在37 ℃條件下攪拌滅活24 h作為實際生產中雞大腸桿菌（O1株、O2株、O78株）菌液的滅活條件。

不同廠家生產的甲醛溶液質量基本一致，無明顯差異。由于實際生產中，菌液量較大，為防止由于濃度過高引起局部的蛋白凝聚和變性，因此建議將甲醛溶液進行稀釋后使用。

本試驗結果是在實驗室小量操作等條件下得出的試驗結果，在具體研究或生產其他菌株大腸桿菌或其他種類細菌時，其滅活工藝還需要另外進行具體地摸索和驗證。盡管如此，依然希望本試驗所得出的數據和結論能對相關研究提供一定意義的參考。

參考文獻：

[1] 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學[CM3].北京：中國農業出版社，2002.857-862.

[2] 才學鵬，景志忠，邱昌慶.動物疫苗學[M].北京：中國農業科學技術出版社，2009.317.

[3] 吳清民.動物傳染病學[M].北京：中國農業大學出版社，2002.514-518.

[4] 馮靜蘭.中華人民共和國獸用生物制品規程[M].北京：化學工業出版社，2000，75-76.