西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯物的制備及鑒定

劉云龍 周 潔 王光文 聶 振

細胞與分子生物學

西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯物的制備及鑒定

劉云龍 周 潔△王光文 聶 振

目的 制備西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯物并鑒定其酶活性與抗體活性。方法采用4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)將西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶進行共價交聯。采用非還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、比色法、間接免疫熒光法對偶聯物進行鑒定并檢測β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗的活性。結果在電泳圖上可分別見到β葡萄糖苷酶、西妥昔單抗、西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯物的清晰條帶。比色法測定結果顯示，西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L：672.97±46.19 vs 869.50±57.28，t=5.972，P＜0.05)，但仍保持良好的酶活性。在熒光顯微鏡下可見到與偶聯物共同作用的人膀胱癌EJ細胞帶有紅色熒光。結論Sulfo-SMCC可成功將西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶偶聯，且偶聯物仍能保持良好的酶活性與抗體活性。

西妥昔單抗；β-葡萄糖苷酶；偶聯物；膀胱腫瘤；癌；Sulfo-SMCC

化療是目前治療腫瘤的主要方法之一，提高化療藥物的治療效果，降低其不良反應一直是研究熱點。抗體介導的酶前體藥物療法(antibody directed enzyme prodrug therapy,ADEPT）是先將酶導向靶部位，再給予無抗癌活性或低活性的前體藥物，在酶的催化下將其轉化為細胞毒性藥物，從而實現抗癌藥物在靶部位特異性釋放的一種方法，該療法不僅提高了藥物對腫瘤細胞的殺傷效率，而且很大程度上降低了化療藥物引起的不良反應[1-2]。β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前藥療法是使用較多的ADEPT之一，苦杏仁苷本身毒性很低，經β-葡萄糖苷酶激活后可以產生氫氰酸（HCN），抑制細胞呼吸，導致細胞死亡[3]。西妥昔單抗是一種新型的人-鼠單克隆嵌合抗表皮生長因子受體（EGFR）抗體，其能夠將酶導向靶部位，實現藥物的特異性靶向殺傷作用，在EGFR陽性的惡性腫瘤中能發揮出色的抗腫瘤活性，顯著增強放療和化療的效果，目前主要應用于結直腸癌和頭頸部鱗癌的治療，在膀胱癌方面的應用還比較少[4]。本研究通過化學偶聯的方法制備西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯物并鑒定其酶活性與抗體活性，以期為進一步研究其對膀胱癌的療效奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 西妥昔單抗購自德國Merck公司；4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)、Traut’s試劑購自美國Thermo Fisher公司；純化脫鹽柱購自美國Thermo公司；Amicon Ultra-15超濾離心管購自美國Millipore公司；人膀胱癌EJ細胞株購自南京凱基細胞公司；羅丹明標記羊抗人IgG購自北京博奧森生物技術有限公司；β-葡萄糖苷酶、對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物的制備 取4 mg西妥昔單抗，采用含2 mmol/L EDTA的PBS（pH 8.0）稀釋其至2 g/L，然后加入Traut’s試劑74 μg，室溫搖床反應1 h，純化脫鹽、超濾除去過量的巰基化試劑及其他反應雜質，濃縮后即得到巰基化的西妥昔單抗1 mL。稱取β-葡萄糖苷酶9.2 mg，用1 mL PBS(pH 7.5，0.01 mol/L)溶解，加入10 mmol/L的異型雙功能偶聯劑衍生物Sulfo-SMCC溶液220 μL，室溫搖床反應1 h，采用同上方法除去過量的Sulfo-SMCC及雜質，濃縮活化β-葡萄糖苷酶至4 mL。將上述制備的西妥昔單抗加入到活化好的β-葡萄糖苷酶溶液中，室溫攪拌反應2 h，超濾除去過量的β-葡萄糖苷酶及其他反應雜質，濃縮后即得到西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物。

1.2.2 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物的鑒定 （1）非還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定偶聯物。分別取適量西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶溶液、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物使用上樣緩沖液進行適當稀釋，進行7％非還原型SDS-PAGE，以鑒定西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物的連接情況。（2）比色法鑒定西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物酶活性。將β-葡萄糖苷酶溶液、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物分別用PBS調整為相同的濃度0.5 g/L，以β-葡萄糖苷酶溶液作為對照測定偶聯物的酶活性。取2支10 mL離心管分別加入4.9 mL底物液[用檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 6.0，0.1 mol/L）將對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷配成終濃度為5 mmol/L底物液]和0.1 mL β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物，37℃水浴反應，5 min、15 min時分別取出0.5 mL反應液，加入1 mL碳酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）終止反應。從各管終止液反應體系中取200 μL加入96孔板，設3個復孔，根據底物水解后釋放出來的對硝基苯酚在405 nm處的特征吸收峰，在酶標儀下測定每孔吸光度（A405）值。參照文獻[5]計算酶活性（U/L）。（3）間接免疫熒光法檢測西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物。取對數生長期人膀胱癌EJ細胞接種于6孔板(1×106個/mL)，培養至貼壁，用PBS洗滌2遍，加入200 μL 2％BSA 37℃封閉60 min，PBS洗滌2遍，選擇其中3孔加入適當稀釋后的西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物100 μL，剩余3孔加入PBS 100 μL作為陰性對照，4℃靜置60 min。PBS洗滌2遍，分別加入50 μL羅丹明標記羊抗人IgG，4℃靜置30 min，PBS洗滌3遍后，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件包進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物的SDSPAGE結果 在1、2泳道可見到與β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對應位置的條帶；3泳道高分子質量端可見到清晰的條帶，而在西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶相對應的位置未見條帶，表明西妥昔單抗與β-葡萄糖苷酶偶聯成功，見圖1。

Fig.1 Cetuximab-β-glucosidase conjugate 7％non-reduced SDSPAGE results圖1 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物7％非還原型SDSPAGE結果

2.2 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物的酶活性測定結果 與相同濃度的β-葡萄糖苷酶相比，西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物酶活性有所下降(U/L：672.97±46.19 vs 869.50±57.28，t=5.972，P＜0.05)。

2.3 間接免疫熒光檢測結果 與西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物共同作用的人膀胱癌EJ細胞在熒光顯微鏡下可見到紅色熒光，而對照組無熒光，見圖2。

3 討論

隨著對蛋白交聯技術的研究，人們發展了一系列異型雙功能交聯試劑用于蛋白質間的交聯，其中馬來酰亞胺基類活潑酯是應用較為普遍的一種，包括（N-馬來酰亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC）、N-羥基琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)等。SMCC是對抗體進行酶標記的理想試劑，可較好地保持酶和抗體的活性，其交聯原理是首先將含有氨基的蛋白質與幾倍劑量的偶聯劑反應，反應結束后通過脫鹽、超濾等方法除去沒有反應完的SMCC，再與含有巰基的蛋白質反應[6]。在探索抗體與酶偶聯的過程中，筆者首先采用了本課題組使用的偶聯劑SPDP，其偶聯原理較SMCC復雜，蛋白質之間會產生一部分自身交聯產物，且其純化過程繁瑣，導致偶聯物產量低、純度低等不足[7]。采用SMCC進行偶聯只需兩步反應，在經過脫鹽、超濾后即可得到純度高的偶聯產物，同時偶聯物保持了良好的活性。因此，SMCC是對抗體進行酶標記的理想試劑。而SMCC難溶于水，在進行蛋白修飾前必須先將SMCC溶于有機溶劑如DMSO或DMF中，為避免加入有機溶劑對蛋白活性造成的影響，本實驗采用了其磺化后的衍生物Sulfo-SMCC。

應用Sulfo-SMCC偶聯后，本研究通過非還原型SDS-PAGE對產物進行了初步鑒定，在3泳道高分子質量端可見到清晰的條帶，而在西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶相對應的位置未見條帶。用比色法測定后發現偶聯物中β-葡萄糖苷酶的酶活性低于同等濃度β-葡萄糖苷酶活性。間接免疫熒光法測定結果示西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶在偶聯后抗體活性仍然存在。表明西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯物已成功制備，為進一步研究其抗腫瘤效應奠定了實驗基礎。

西妥昔單抗可與EGFR的內源性配體競爭性地與EGFR胞外配體結合區相結合，阻斷EGFR二聚體的形成，從而抑制癌細胞的增殖和腫瘤生長[8]。 Bhuvaneswari等[9]將西妥昔單抗與光動力療法（PDT）聯合應用于膀胱腫瘤異種移植模型，發現與單獨PDT相比，聯合應用能夠顯著地抑制腫瘤的生長。EGFR是一種跨膜糖蛋白，在膀胱癌、頭頸部鱗癌、以及前列腺癌中有過量表達，為腫瘤治療提供了一個理想靶點[10]。此外，在膀胱癌靶向治療研究中，EGFR通路在細胞增殖、凋亡、分化、遷移和血管生成中也起到關鍵作用[11]。

Fig.2 Immunofluorescence images of cetuximab-β-glucosidase coupling product(×400)圖2 西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯產物的免疫熒光檢測結果（×400）

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（2014-07-07收稿 2014-08-12修回）

（本文編輯 閆娟）

Preparation and Identification of Cetuximab-β-Glucosidase Conjugates

LIU Yunlong,ZHOU Jie△,WANG Guangwen,NIE Zhen
Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China△

E-mail：zhoujieuser@163.com

ObjectiveTo prepare cetuximab-β-glucosidase conjugates and to identify its enzymatic activity and antibody activity.MethodsCetuximab and β-glucosidase were crosslinked by Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC).Cetuximab-β-glucosidase conjugates and its enzymatic and antibody activity were examined by non-reduced SDS-PAGE,colorimetry and indirect immunofluorescence assay.ResultsWe can see clear bands of β-glucosidase,cetuximab,cetuximab-β-glucosidase conjugates through electropherogram.Although the enzymatic activity of cetuximab-β-glucosidase conjugates was lower than that of β-glucosidase(U/L：672.97±46.19 vs 869.50± 57.28，t=5.972，P＜0.05)shown by colorimetry assay,it still maintain good enzymatic activity.Under fluorescence microscope,we can see the conjugates interacted with human bladder cancer EJ cells are in a red fluorescence.ConclusionCetuximab,β-glucosidase were crosslinked successfully by Sulfo-SMCC without altered its enzymatic and antibody activity.

cetuximab;β-glucosidase;conjugates;urinary bladder neoplasms;carcinoma;Sulfo-SMCC

R737.1，R73-36

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.001

國家自然科學基金資助項目（81160314）

廣西醫科大學第一附屬醫院泌尿外科（郵編530021）

△通訊作者 E-mail：zhoujieuser@163.com