姜黃素的抗胰腺癌作用及相關機制研究

谷倬宇 李思源 肖智偉 周 婷 李 軍△

姜黃素的抗胰腺癌作用及相關機制研究

谷倬宇1,2李思源2肖智偉1,2周 婷1李 軍1,2△

目的 探討姜黃素(curcumin)的抗胰腺癌作用及其可能的機制。方法采用免疫組化法檢測35例胰腺癌組織及相鄰非癌組織中Smad4、Jab1的表達情況，并從中抽取21例胰腺癌組織測定Jab1與Smad4染色的陽性細胞百分比，分析兩者相關性。將人胰腺癌細胞系PANC-1細胞分為PANC-1對照組（不做處理）和PANC-1 curcumin組（含10 μmol/L姜黃素的細胞培養液處理），采用Western Blot檢測姜黃素對腫瘤抑制物p53、Smad4及細胞循環抑制劑p27蛋白表達的影響。將人胚腎細胞系293T細胞分為293T對照組（不做處理）、293T curcumin組（含10 μmol/L姜黃素的細胞培養液處理）和293T Jab1組（轉染HA-Jab1質粒），采用免疫共沉淀法檢測姜黃素對β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達影響。結果與相鄰非癌組織比較，胰腺癌組織中Smad4呈低表達，Jab1呈高表達（均P＜0.01），Jab1與Smad4的表達呈負相關(n=21，r=-0.71，P=0.007)。姜黃素可增加PANC-1細胞中Smad4、p53 和p27蛋白表達的水平，降低293T細胞中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平；Jab1可增加293T細胞中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平（均P＜0.05）。結論姜黃素可能通過上調Smad4、p53和p27的蛋白表達進而起到抗胰腺癌作用，其上調Smad4表達的機制可能與其抑制Smad4蛋白的泛素化進程有關，而Jab1也可能通過參與Smad4的泛素化進程影響Smad4蛋白降解。

胰腺腫瘤；姜黃素；Smad4蛋白質；腫瘤抑制蛋白質p53；周期素依賴激酶抑制劑p27；泛素化；Jab1

姜黃素（curcumin）是一種天然植物提取物，在中國及印度已被用作藥物來治療疾病，具有廣泛的藥理作用，包括抗感染、抗腫瘤、抗氧化及促進傷口愈合等[1]，其抗腫瘤機制在于它能作用于轉錄因子、生長調節因子、黏附分子、凋亡基因、血管生成調節因子及細胞信號分子等[2-3]。姜黃素作為Jab1相關激酶抑制劑，已有研究證實其在肝癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤中存在抗腫瘤作用[4-5]，然而其在胰腺癌中的作用及作用機制尚不明確。有研究顯示在胰腺癌細胞系中Smad4蛋白低表達[6]，但Jab1蛋白的表達情況尚少見報道。本研究通過檢測胰腺癌組織中Smad4、Jab1的蛋白表達情況，探討二者在胰腺癌中的相關性，觀察并分析Jab1相關激酶抑制劑姜黃素對胰腺癌細胞系中腫瘤抑制物Smad4、p53和細胞循環抑制劑p27蛋白表達的影響，旨在探討姜黃素對胰腺癌的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 35例胰腺癌冰凍及石蠟包埋組織來自于我院病理科臨床資料完整的胰腺癌手術患者，其中男21例，女14例，年齡60～81歲，平均（70.41±6.32）歲。正常對照組織來自于胰腺癌相鄰非癌組織。人胰腺癌細胞系PANC-1和人胚腎細胞系293T購自中國科學院上海細胞庫。pMSCVneo/ HA-Jab1、pMSCVneo/Flag-Smad4逆轉錄病毒質粒由美國阿拉巴馬伯明翰大學惠贈。兔抗人Jab1多克隆抗體、鼠抗人Smad4單克隆抗體、p27抗體、p53抗體、β-TrCP1抗體購自Santa Cruz公司，β-actin抗體、Flag抗體、姜黃素購自Sigma公司，HA抗體購自CRP公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組處理及轉染 293T細胞、PANC-1細胞用含10％胎牛血清的DMEM培養基，在37℃、5％CO2的培養箱中進行培養。細胞貼壁生長，每3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。將PANC-1細胞分為2組，不做任何處理的細胞為PANC-1對照組，含10 μmol/L姜黃素的細胞培養液處理的細胞為PANC-1 curcumin組。293T細胞長至80％密度時轉染Flag-Smad4質粒，轉染24 h后收獲細胞，采用完全隨機設計方法將細胞分為3組，不做任何處理的細胞為293T對照組，含10 μmol/L姜黃素的細胞培養液處理的細胞為293T curcumin組，再次轉染HA-Jab1質粒的細胞為293T Jab1組。

1.2.2 免疫組化染色 將4 μm的貼鄰切片脫蠟水化后，用新鮮配制的3％雙氧水室溫封閉10 min，PBS洗后滴加正常的山羊血清封閉液20 min，甩去多余液體。4℃滴加一抗過夜，一抗稀釋1∶100的比例，37℃復溫45 min，室溫下滴加生物素化二抗30 min，鏡下控制DAB顯色后用自來水清洗，蘇木素復染。在未知病理資料情況下，由2名病理科醫生判定，結果一致可判斷為陽性。從35例胰腺癌標本中隨機抽取21例測定同一張切片上Jab1與Smad4染色的陽性細胞百分比，分析Jab1與Smad4的關系。

1.2.3 Western Blot檢測 PANC-1細胞處理24 h后，預冷PBS洗滌，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g 4℃離心，收集上清后加入100 μL 1×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白質變性，用10％SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Smad4、p53、p27及β-actin一抗4℃過夜，過夜后加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗室溫孵育1 h，然后于Bio-Rad凝膠成像儀中進行顯影，條帶灰度值用Bio-Rad凝膠成像系統進行圖像分析，重復3次。

1.2.4 免疫共沉淀反應 293T細胞處理6 h后，預冷PBS洗滌加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g 4℃離心，收集上清，加入β-TrCP1抗體，4℃緩慢搖動過夜，次日加入30 μL protein G beads，4℃緩慢搖動2 h，1 000×g 4℃離心5 min，用不含PMSF的細胞裂解液洗滌beads 3次，加入100 μL 1×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，離心取上清做Western Blot檢測。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS 18.0軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；相關分析行Pearson相關。計數資料組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Smad4、Jab1在胰腺癌及相鄰非癌組織中的表達 Smad4在胰腺癌組織中的陽性表達率明顯低于相鄰非癌組織，Jab1在胰腺癌組織中的陽性表達率明顯高于相鄰非癌組織（均P＜0.01），見表1。21例胰腺癌標本中Jab1陽性細胞百分比與Smad4陽性細胞百分比呈負相關(r=-0.71,P=0.007)，見圖1。

2.2 姜黃素對胰腺癌細胞中Smad4、p53及p27蛋白表達的影響 與PANC-1對照組相比，姜黃素可明顯增加PANC-1細胞中Smad4、p53及p27蛋白的表達水平（P＜0.01），見圖2、表2。

Tab.1 Protein expressions of Smad4 and Jab1 in PC tissues and pericarcinomatous tissues表1 Smad4、Jab1在胰腺癌及相鄰非癌組織中的表達例(％)

Fig.1 The correlation of Smad4 expression with Jab1 expression in pancreatic cancer tissues圖1 胰腺癌組織中Smad4與Jab1表達的相關性

Fig.2 Protein expression levels of Smad4,p53 and p27 in two groups圖2 2組細胞中Smad4、p53及p27蛋白的表達水平

Tab.2 Comparison of protein expression levels of Smad4，p53 and p27 between two groups表2 2組細胞中Smad4、p53及p27蛋白的相對表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of Smad4，p53 and p27 between two groups表2 2組細胞中Smad4、p53及p27蛋白的相對表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別PANC-1對照組PANC-1 curcumin組t Smad4 0.42±0.05 0.71±0.04 61.537＊＊p53 0.24±0.04 0.52±0.03 94.080＊＊p27 0.35±0.06 0.93±0.02 252.300＊＊

2.3 姜黃素對293T細胞中泛素化連接酶β-TrCP1 與Smad4相互作用的影響 與293T對照組相比，293T curcumin組中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平明顯降低，293T Jab1組中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平明顯升高（均 P＜0.05）。見圖3、4。

Fig.3 The protein expression levels of the combination of β-TrCP1 and Smad4 in three groups圖3 3組細胞中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平

Fig.4 Comparison of protein expression levels of the combination of β-TrCP1 and Smad4 in three groups圖4 3組細胞中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平比較

3 討論

胰腺癌是一個多基因、多步驟的發展過程，涉及多個原癌基因和抑癌基因的突變，其中最主要的是K-ras、p53、p16、DPC4/Smad4基因。近年來的研究證實抑癌基因Smad4/DPC4與胰腺癌的發病機制密切相關[7]。本研究結果顯示，在胰腺癌組織中，Smad4蛋白表達明顯降低，此結果與國外研究結果一致[8]。Jab1即CSN5，是COP9信號復合物（CSN）的第5個組分，已有研究發現，Jab1在多種腫瘤中高表達，包括胰腺癌[9]，但具體機制不明。本研究中Jab1在胰腺癌組織中呈高表達，與Smad4的表達呈負相關，提示Jab1高表達及Smad4低表達與胰腺癌的發生發展可能密切相關，二者可能是胰腺癌發病機制的一個重要組成部分。

姜黃素作為Jab1相關激酶抑制劑，已證實在許多腫瘤中具有抗腫瘤活性[10]，有研究表明其作用機制可能與Notch-1及核因子（NF）-κB信號途徑及其下游基因相關[11]，但具體機制不明。He等[12]研究發現，姜黃素可通過上調結腸癌細胞中p53的表達進而加速癌細胞的凋亡，p53的表達很可能是姜黃素的一個重要調控點。Maher等[13]在宮頸癌細胞中也證實了姜黃素可通過調控p53蛋白表達參與宮頸癌的發生發展。Aggarwal等[14]在人乳腺癌細胞和前列腺癌細胞中也發現姜黃素可通過上調細胞中的p53 及p27的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。本研究結果顯示，姜黃素可上調胰腺癌細胞中腫瘤抑制物Smad4、p53和細胞循環抑制劑p27的蛋白表達，提示姜黃素可能通過上調胰腺癌細胞中Smad4、p53 及p27的表達進而起到抗胰腺癌作用。

泛素-蛋白酶體途徑是主要調節蛋白降解的系統之一，研究表明泛素化連接酶β-TrCP1在Smad4蛋白的泛素化及進一步降解中起著重要作用[15]。本研究結果顯示，293T curcumin組中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平明顯低于對照組，提示姜黃素可抑制β-TrCP1與Smad4的相互結合，從而可能通過抑制Smad4的泛素化，進而減少Smad4作為底物被泛素-蛋白酶體系統降解，使其蛋白的穩定性及表達增加。而 293T Jab1組中β-TrCP1與Smad4結合的蛋白表達水平明顯高于對照組，提示Jab1可能通過促進Smad4的泛素化，使Smad4蛋白的穩定性及表達下降，結合胰腺癌組織中Jab1與Smad4的蛋白表達呈負相關，也進一步提示Jab1與Smad4的不穩定密切相關，姜黃素可能通過抑制Smad4的泛素化進程進而抑制其降解，從而上調Smad4表達起到抗胰腺癌作用。

綜上所述，姜黃素作為Jab1相關激酶抑制劑可能通過上調Smad4、p53和p27的蛋白表達進而起到抗胰腺癌作用，其上調Smad4表達的機制可能與其抑制Smad4蛋白的泛素化進程有關，而Jab1也可能通過參與Smad4的泛素化進程影響Smad4蛋白降解。

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（2014-05-09收稿 2014-08-12修回）

（本文編輯 陳麗潔）

The Anti-Tumor Effect and Mechanism of Curcumin in Pancreatic Cancer

GU Zhuoyu1,2，LI Siyuan2，XIAO Zhiwei1,2，ZHOU Ting1，LI Jun1,2△
1 First Affiliated Hospital,Medical College of Shihezi University,Shihezi 832002,China;2 Medical College of Shihezi University,Key Laboratory of Ministry of Education,Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases
△

E-mail：xjlijun@163.com

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect and mechanism of curcumin in pancreatic cancer(PC).MethodsSmad4 and Jab1 expressions were detected by immunohistochemistry in tumor tissues and pericarcinomatous tissue from 35 PC cases,and the correlation of Smad4 and Jab1 were analyzed based on the percentage of positive staining intissues from 21 random selected PC cases.The effect of curcumin on expressions of tumor suppressors p53,Smad4 and cell cycle inhibitor p27 were examined by Western Blotting after human pancreatic cancer cell line PANC-1 were divided into PANC-1 control group(no treatments were given)and PANC-1 curcumin group(treated with cell culture medium containing 10 μmol/L curcumin).The effect of curcumin on expressions of combination of β-TrCP1 and Smad4 was examined by Co-Immunoprecipitation after human embryonic kidney cell line 293T were divided into 293T control group(no treatments were given),293T curcumin group(treated with cell culture medium containing 10 μmol/L curcumin)and 293T Jab1 group(transfected by HA-Jab1 plasmid).ResultsCompared with expressions in pericarcinomatous tissues,Smad4 was down regulated while the expression of Jab1 was upregulated in PC tissues(P＜0.01),and the expression of Smad4 was negatively correlated with the expression of Jab1(n=21,r=-0.71,P=0.007).After treated with curcumin,the protein expression of p53,Smad4and p27 was increased in PANC1 cell,and the protein expression of the combination of β-TrCP1 and Smad4 was decreased in 293T cell(P＜0.05).After transfected by HA-Jab1 plasmid,the protein expression of the combination of β-TrCP1 and Smad4 was increased in 293T cell(P＜0.05).ConclusionCurcumin may have suppression effect of PC through increasing the protein expression of p53,Smad4 and p27,and the mechanism of Smad4 upregulation may be related with the inhibition of Smad4 ubiquitination process,while Jab1 may be also involved in Smad4 degradation through ubiquitination.

pancreatic neoplasms;curcumin;Smad4 protein;tumor suppressor protein p53;cyclin-dependent kinase inhibitor p27;ubiquitination;Jab1

R735.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.003

新疆生產建設兵團國際合作基金資助項目（2011BC005）

1石河子大學醫學院第一附屬醫院（郵編832002）；2石河子大學醫學院，新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室

△通訊作者 E-mail:xjlijun@163.com