子宮內膜異位癥中子宮內膜間質細胞侵襲、轉移能力的研究

蘇曉華宋殿榮 張 崴郭 潔王雅楠趙 琳

子宮內膜異位癥中子宮內膜間質細胞侵襲、轉移能力的研究

蘇曉華1宋殿榮2△張 崴2郭 潔2王雅楠2趙 琳2

目的 檢測子宮內膜異位癥（EMs）患者子宮內膜間質細胞中環氧化酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）、鋅指轉錄因子（Snail）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）mRNA表達情況，分析EMs中子宮內膜間質細胞的侵襲、轉移能力。方法收集EMs患者的在位及異位病灶子宮內膜組織和子宮肌瘤患者的在位內膜組織，原代消化培養子宮內膜細胞，取純化的第4代子宮內膜間質細胞進行研究，RT-PCR法檢測細胞COX-2、PGE2、Snail和E-cadherin mRNA的表達。結果EMs和子宮肌瘤患者分泌期在位子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail和E-cadherin mRNA表達與增殖期比較差異均無統計學意義；EMs患者在位及異位的子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail mRNA表達比肌瘤患者在位細胞均明顯升高，而E-cadherin mRNA表達降低（P＜0.05或P＜0.01）；EMs患者異位的子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail mRNA表達比在位間質細胞升高，而E-cadherin mRNA表達降低（P＜0.05或P＜0.01）。結論EMs患者的子宮內膜間質細胞侵襲、轉移能力強于非EMs患者，且在EMs發病中異位病灶子宮內膜間質細胞的侵襲、轉移能力更強。

子宮內膜異位癥；環氧化酶-2；前列腺素E2；鋅指轉錄因子；E-鈣黏蛋白

子宮內膜異位癥（EMs）是婦科常見疾病，可引起10％～15％的育齡期婦女不孕和盆腔痛，其雖為良性疾病，卻具有無限生長、生成新生血管、浸潤并破壞周圍組織和局部或遠處轉移等惡性腫瘤的一些特性。子宮內膜間質細胞具有持續增殖、抗凋亡、促進血管生成、侵襲、轉移和調節局部免疫系統等作用。本研究利用子宮內膜細胞體外培養技術，采用RTPCR法研究體外培養的EMs患者在位及異位子宮內膜間質細胞中環氧化酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）、鋅指轉錄因子（Snail）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表達，探討EMs中在位及異位子宮內膜間質細胞的侵襲、轉移能力。

1 材料與方法

1.1 標本采集 標本取自2012年10月—2013年12月在天津中醫藥大學第二附屬醫院婦科因子宮肌瘤、卵巢巧克力囊腫行手術治療的已婚婦女，患者年齡23～49歲，平均（32.56±7.42）歲，既往均月經規律，未放置宮內節育器，術前6個月內未服用抗炎、激素類等藥物治療。在位子宮內膜組織取自術前行診斷性刮宮術的內膜，病理證實子宮內膜無病理性改變；異位內膜組織取自手術切除的卵巢異位病灶，術后病理證實符合EMs。共收集子宮肌瘤患者在位子宮內膜組織30例，其中增殖期內膜18例，分泌期12例；EMs患者在位內膜組織35例，其中增殖期內膜25例，分泌期10例；卵巢異位病灶35例。所有標本的采集均得到患者本人或家屬知情授權，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 培基（HyCloneSH30023.01B）、胎牛血清（HyCloneSV30087.02）、胰酶（Invitrogen）、雙抗（GIBCO 15140-122）、Ⅰ型膠原酶（SIGMA）、無酶水（QIAGEN 129115）、抗波形蛋白抗體（Abcam ab8069）、抗角蛋白抗體（Abcam ab7754）、藻紅蛋白抗體（VECTOR EI-2007）、總RNA提取試劑盒（天根，DP419）、Quant一步法RT-PCR試劑盒（天根，KR113）。

1.3 主要儀器 二氧化碳培養箱（CH9-80）、倒置顯微鏡（37XB）、低速臺式離心機（L-500）、微型高速臺式冷凍離心機（H-1600W）、PCR儀（9700）、電泳儀（MiniSC）、凝膠電泳成像儀（ChampGel-5000）、紫外可見分光光度計（UV7804）。

1.4 實驗方法

1.4.1 取材 將標本迅速放入裝有冰全培基（含有1％雙抗、10％胎牛血清、89％DMEM/F12）的離心管中，30 min內移入實驗室于紫外線消毒后的超凈臺中進行操作。

1.4.2 子宮內膜細胞原代培養 取材后將無菌離心管中的標本倒入消毒后的無菌培養皿中，用無菌冰Hanks漂洗3～5次，去除血塊，至組織變白凈。用眼科剪將組織剪成約1 mm3的碎塊，放入15 mL無菌離心管中，加入3倍體積消化酶，用移液器輕柔吹打混合均勻后，置于37℃恒溫箱中消化40 min，同時輕輕搖晃，使細胞和消化酶充分接觸，徹底消化，直至組織呈云霧狀。加入含10％胎牛血清的DMEM/F12全培基終止消化，吹打混勻，400 r/min的速度離心3 min，使組織沉淀，將上清液移入15 mL離心管中，1 000 r/min速度離心7 min，棄上清液，加入全培基懸浮細胞，進行細胞計數，以1× 105/mL密度接種于25 cm2培養瓶中，置37℃、5％CO2的培養箱內培養，24 h后觀察細胞貼壁情況并換液，隔48 h換液1次。

1.4.3 子宮內膜細胞傳代培養 倒置顯微鏡下觀察，當原代細胞長滿瓶壁約80％時進行傳代，棄去培養瓶中的培養液，無菌PBS洗滌3次，加入0.25％含EDTA的胰酶3 mL，于37℃培養箱中消化，每3 min輕搖培養瓶1次，顯微鏡下觀察，當細胞收縮變圓即將離開培養瓶時加入全培基終止消化，用移液管反復吹打瓶壁細胞，將細胞懸液移入15 mL離心管中，1 000 r/min離心7 min，棄上清，加入全培基混勻，進行細胞計數，以1∶2或1∶3比例傳代，置37℃、5％CO2的培養箱內培養，隔48 h換液1次。

1.4.4 子宮內膜間質細胞分離純化 參考Beliard等[1]用差速沉降法結合篩網過濾法將子宮內膜間質細胞與腺上皮細胞分離、純化，具體方法是將胰酶消化后的第2代子宮內膜細胞懸液經250 μm篩網過濾去除黏液和未消化的組織，加10 mL全培基混勻，靜置30 min，吸取頂部8 mL細胞懸液移入新的15 mL離心管中，1 000 r/min離心7 min，棄上清，再加入10 mL全培基混勻，靜置30 min，將頂部8 mL細胞懸液經400 μm篩網過濾去除殘留的腺上皮細胞團，收集過濾后的間質細胞加入全培基混勻，進行細胞計數，以1×105/mL密度接種于25 cm2培養瓶中，置37℃、5％CO2的培養箱內培養，24 h后觀察細胞貼壁情況并換液，隔48 h換液1次。

1.4.5 子宮內膜間質細胞鑒定 （1）吉姆薩染色形態學鑒定。將純化后的第4代子宮內膜間質細胞接種到6孔板內，待細胞長滿40％時進行形態學鑒定。4％甲醛固定3 min，PBS洗滌2 min×3遍，吉姆薩染色液室溫染色15 min，PBS洗滌2 min×3遍，晾干后于顯微鏡下觀察。（2）免疫熒光鑒定。將純化后的第4代子宮內膜間質細胞接種到6孔板內，待細胞長滿40％時進行免疫熒光鑒定。4％甲醛固定10 min，PBS洗滌2 min×3遍，0.1％Triton×100室溫透化5 min，PBS清洗2 min×3遍，2％BSA室溫封閉1 h，吸去BSA，加入一抗（鼠抗人波形蛋白和鼠抗人角蛋白，1∶200濃度），PBS作陰性對照組，封閉孔板，4℃避光過夜。PBS清洗2 min×3遍，10 mg/L藻紅蛋白室溫孵育1 h，吸棄，PBS清洗2 min×3遍，避光，5 mg/L Hoechst室溫復染核3 min，PBS清洗2 min×6遍，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.6 子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail和E-cadherin mRNA表達檢測 將第4代子宮內膜間質細胞接種到75 cm2培養瓶，待細胞長滿后消化，采用RT-PCR法檢測COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達。（1）子宮內膜間質細胞總RNA提取。嚴格按試劑盒說明操作，測定光密度（OD）260及OD280以估算總RNA的濃度及純度，并用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性，提取的總RNA于-80℃保存。（2）引物序列。見表1。（3）RT-PCR擴增反應。取1 μg總RNA，分別擴增COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin及β-actin基因，反應體系為25 μL，反應條件：50℃30 min，94℃預變性2 min；94℃變性45 s，53～56℃退火45 s（根據不同目的基因選擇相應的退火溫度），65℃延伸1 min，共35次循環；65℃終延伸10 min，4℃保存。取各組PCR產物7 μL加入樣本孔中行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在200 mA電流下電泳15 min，紫外燈下觀察電泳條帶，每個樣本經PCR擴增后以Marker作為參照。（4）PCR產物半定量分析。PCR產物電泳后經Gel-PRO ANALYZER凝膠定量分析軟件對電泳條帶進行灰度分析，目的基因相對表達強度=目的基因電泳條帶灰度值/β-actin內參照條帶灰度值。每個樣本重復4次實驗。

Tab.1 Primer sequences of COX-2，PGE2，Snail，E-cadherin and β-actin for RT-PCR表1 COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin、β-actin的引物序列

1.5 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件進行分析處理，數據以±s表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。3組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞培養情況及鑒定 30例子宮肌瘤患者在位子宮內膜中29例成功培養出子宮內膜細胞，1例染菌；35例巧克力囊腫患者在位內膜中33例成功培養出子宮內膜細胞，2例染菌，異位病灶中25例成功培養出子宮內膜細胞，10例因病灶過小未培養出細胞，無染菌標本。經差速沉降法結合篩網過濾法獲得的子宮內膜間質細胞純度可達95％，第4代間質細胞經吉姆薩染色可見細胞呈梭形，胞核呈橢圓形，未見多角形的腺上皮細胞；免疫熒光鑒定結果鼠抗人角蛋白（Cytokeratin）染色陰性，而鼠抗人波形蛋白（Vimentin）染色陽性，見圖1，證實研究的子宮內膜細胞中以間質細胞為主。

2.2 子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達水平比較

2.2.1 子宮內膜細胞總RNA提取結果 所提取的細胞總RNA OD260/OD280介于1.8～2.0，電泳可見清晰的18 S和28 S 2個條帶，且2條帶的OD比值為28 S∶18 S＞2∶1，說明所提取的總RNA純度較高且較完整，無DNA、酚、蛋白的污染，見圖2。

Fig.2 Agarose gel electrophoresis to identify RNA integrity圖2 RNA完整性瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2.2 半定量RT-PCR結果 （1）增殖期、分泌期在位子宮內膜間質細胞半定量RT-PCR電泳灰度值比較。子宮肌瘤及EMs患者分泌期子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達與增殖期間質細胞比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、4，表2。（2）EMs在位及異位子宮內膜間質細胞半定量RT-PCR電泳灰度值比較。各組患者異位子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達差異均有統計學意義，其中COX-2、PGE2、Snail在EMs患者異位子宮內膜間質細胞表達最高，EMs在位間質細胞表達次之，子宮肌瘤患者在位間質細胞表達最低；而E-cadherin表達情況相反，見圖5、表3。

Fig.3 Amplification products of target gene from eutopic endometrial stromal cells of patients with uterine fibroids圖3 子宮肌瘤患者在位子宮內膜間質細胞目的基因擴增產物

Fig.4 Amplification of target gene in eutopic endometrial stromal cells from patients with EMS圖4 EMs患者在位子宮內膜間質細胞目的基因擴增產物

Fig.5 Amplification of target gene in eutopic and ectopic endometrial stromal cells圖5 子宮肌瘤位內膜、EMs在位及異位子宮內膜間質細胞目的基因擴增產物

Tab.2 Comparison of transcription levels of COX-2,PGE2,Snail and E-cadherin between proliferative stage and secretory stage of eutopic endometrial stromal cells表2 增殖期、分泌期在位子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達量比較（±s）

Tab.2 Comparison of transcription levels of COX-2,PGE2,Snail and E-cadherin between proliferative stage and secretory stage of eutopic endometrial stromal cells表2 增殖期、分泌期在位子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達量比較（±s）

均P＞0.05

組別肌瘤在位內膜n 17 12 EMs在位內膜增殖期分泌期t增殖期分泌期t 23 10 COX-2 0.597±0.019 0.601±0.022 0.330 0.747±0.048 0.751±0.073 0.112 PGE20.542±0.047 0.555±0.052 0.459 0.646±0.044 0.666±0.069 0.593組別肌瘤在位內膜n 17 12 EMs在位內膜增殖期分泌期t增殖期分泌期t 23 10 Snail 0.656±0.114 0.684±0.063 0.525 0.857±0.059 0.884±0.091 0.614 E-cadherin 0.936±0.032 0.967±0.054 1.197 0.756±0.080 0.762±0.079 0.119

Tab.3 Comparison of transcription levels of COX-2, PGE2,Snail and E-cadherin in endometrial stromal cells between each group表3 各組子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達量比較 （±s）

Tab.3 Comparison of transcription levels of COX-2, PGE2,Snail and E-cadherin in endometrial stromal cells between each group表3 各組子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2、Snail、E-cadherin mRNA表達量比較 （±s）

＊＊P＜0.01，a與EMs異位組比較，b與EMs在位組比較，P＜0.05

組別EMs異位EMs在位肌瘤在位F n 25 33 29 COX-2 0.846±0.074 0.763±0.058a0.598±0.016ab31.512＊＊PGE20.722±0.036 0.646±0.043a0.599±0.015ab20.277＊＊Snail 0.993±0.156 0.846±0.049a0.690±0.077ab12.723＊＊E-cadherin 0.674±0.079 0.771±0.062a0.916±0.034ab23.663＊＊

3 討論

3.1 子宮內膜間質細胞的選擇 細胞的侵襲和轉移包括細胞通過細胞外基質的主動運動和蔓延到遠處器官。EMs形成過程中經期脫落的子宮內膜細胞通過輸卵管后需經過腹水或腹腔液、腹腔細胞和腹腔細胞外基質這三道防線進入腹腔，然后在盆腹腔腹膜、器官等部位種植生長，形成異位病灶[2]。子宮內膜細胞主要包括子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞，在EMs形成過程中腺上皮細胞參與異位病灶的生長，間質細胞參與異位病灶的黏附過程[3-4]。子宮內膜間質細胞的黏附作用是EMs形成的第一步[4]，之后通過重組腺上皮和間質細胞形成子宮內膜腺體而進一步促進異位病灶的生長[3]。因此，本實驗以原代培養的子宮內膜間質細胞為對象，研究EMs中與細胞侵襲、轉移相關基因的表達。

3.2 COX-2作用途徑與細胞侵襲、轉移可能的關系 細胞外基質和細胞間的黏附作用是防止細胞轉移的基礎，破壞正常細胞間的黏附作用可增強腫瘤細胞的遷移和增殖能力，從而引起細胞的侵襲和轉移。COX-2是催化花生四烯酸轉化為PGE2的誘導酶，與腸癌[5]、卵巢上皮性癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]等惡性腫瘤的發生、發展有關，具有刺激細胞增殖、抑制凋亡、參與細胞侵襲、遠處轉移和促進血管生成的作用。Snail作為E-cadherin的抑制因子，在小細胞肺癌[9]、膀胱癌[10]、乳腺癌[11]等多種惡性腫瘤中表達明顯升高，其主要功能是調控細胞的轉移和生存能力，使腫瘤細胞從原始病灶分離并轉移到身體的其他部位，從而促進細胞的侵襲和轉移。E-cadherin是細胞間黏附和維持正常組織結構的必需蛋白，其降低與腫瘤的侵襲、轉移和不良預后有關。在肺癌中過表達的COX-2誘導產生的PGE2通過促進Snail的表達而抑制E-cadherin的表達，從而使癌細胞的侵襲、轉移能力增加[12]。

3.3 EMs子宮內膜間質細胞的侵襲、轉移能力 本實驗以原代培養的子宮內膜間質細胞為研究對象，可代表患者體內細胞的特征，研究結果顯示子宮肌瘤和EMs患者增殖期在位子宮內膜分離培養的間質細胞COX-2、PGE2、Snail和E-cadherin mRNA表達與分泌期培養的間質細胞比較均無顯著差異，提示體外培養的子宮內膜間質細胞的侵襲、轉移能力不受子宮內膜周期性變化的影響。郎景和教授關于EMs的發病提出了“在位內膜決定論”[2]，即患者的在位內膜本身在黏附、種植、侵襲能力上要強于非EMs婦女，更容易形成異位病灶。該實驗結果顯示EMs患者的子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2和Snail mRNA表達比非EMs患者均升高，而E-cadherin mRNA表達降低，提示EMs患者的子宮內膜間質細胞侵襲、轉移能力強于非EMs患者。有學者指出EMs患者在位子宮內膜細胞要在盆腔內種植形成異位病灶，還要通過腹水、腹腔內細胞、腹膜外細胞基質這三道防線的篩選作用，最后留下最強的克隆細胞系在腹腔內種植形成異位病灶，因此提出子宮內膜異位病灶是單克隆起源學說[13]。對于EMs患者而言，異位病灶子宮內膜間質細胞COX-2、PGE2和Snail mRNA表達比在位內膜細胞均升高，而E-cadherin mRNA表達降低，提示異位子宮內膜間質細胞的功能有所改變，侵襲、轉移能力強于在位子宮內膜間質細胞。

Fig.1 Identification of endometrial cells圖1 子宮內膜間質細胞鑒定

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（2014-06-10收稿 2014-08-03修回）

（本文編輯 李鵬）

Invasion and Metastasis Ability of Endometrial Stromal Cells in Endometriosis

SU Xiaohua1，SONG Dianrong2△，ZHANG Wei2，Guo Jie2，WANG Yanan2，ZHAO Lin2
1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300073,China;2 The Second Affiliated Hospital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
△

E-mail：songdr58@126.com

ObjectiveTo analyze the invasion and metastasis of endometrial stromal cells in endometriosis through assessing the transcription levels of COX-2,PGE2,Snail and E-cadherin mRNA.MethodsEctopic and eutopic endometrial tissues from patients with EMs(endometriosis)or uterine fibroids were collected and cultured.The fourth generation of purified endometrial stromal cells were used for research,and the transcription levels of COX-2,PGE2,Snail and E-cadherin mRNA were analyzed by RT-PCR.ResultsThere were no statistical differences in transcription levels of COX-2,PGE2, Snail and E-cadherin mRNA in eutopic endometrial stromal cells from patients with EMs or uterine fibroids between secration stage and proliferation stage（P＞0.05）.The transcription levels of COX-2,PGE2and Snail mRNA were significantly increased while transcription level of E-cadherin mRNA was decreased in eutopic and ectopic endometrial stromal cells in patients with EM compared with those in patients with uterine fibroid.And the difference was statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.The transcription levels of COX-2,PGE2and Snail mRNA were obviously higher while transcription level of E-cadherin mRNA was lower in ectopic endometrial stromal cells than those in eutopic endometrial stromal cells from patients with EMs.And the difference was statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionThe invasion and metastasis of endometrial stromal cells of patients with EMs were remarkable than those cell of patients without EMs.What’s more,the invasion and metastasis in ectopic endometrial stromal cells were more obvious than those cells in the pathogenesis of EMs.

endometriosis；COX-2；PGE2；Snail；E-cadherin

R711.7

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.004

國家自然科學基金資助項目（81102613）

1天津中醫藥大學（郵編300073）；2天津中醫藥大學第二附屬醫院

△通訊作者 E-mail：songdr58@126.com