靶向Ang-1的siRNA片段逆轉人胃腺癌細胞株BGC-823侵襲表型的研究

邢玉新 王 衛 桑曉旻 趙元順 張春澤

靶向Ang-1的siRNA片段逆轉人胃腺癌細胞株BGC-823侵襲表型的研究

邢玉新1王 衛2桑曉旻2趙元順3張春澤4△

目的 利用RNA干擾技術沉默人胃腺癌細胞株BGC-823中血管生成因子1（Ang-1）的表達，觀察其對腫瘤侵襲性的抑制效果。方法設計靶向Ang-1的siRNA片段并轉染人胃腺癌細胞株BGC-823；RT-PCR方法檢測Ang-1的mRNA水平；Western Blot和細胞免疫熒光方法檢測整合素β1、CD44V6和Ang-1的蛋白表達量和細胞定位；細胞黏附試驗檢測轉染前后細胞黏附能力；Matrigel膠及Transwell雙室培養體系檢測癌細胞侵襲能力。結果RTPCR結果顯示所設計的siRNA片段可有效沉默Ang-1的mRNA表達；整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白主要定位于腫瘤細胞胞漿和胞膜，其表達水平較轉染siRNA片段前均有不同程度降低；細胞黏附能力和侵襲能力均明顯降低（P＜0.01）。結論靶向Ang-1的siRNA技術可有效降低人胃腺癌細胞株BGC-823的侵襲能力，為胃癌基因治療提供了新的思路。

血管生成素1；RNA干擾；胃腫瘤；腫瘤侵潤；抗原,CD29；抗原,CD44

瘤細胞轉移是惡性腫瘤的重要表征，也是腫瘤術后復發的主要原因[1]。血管生成因子1（angiopoietin-1,Ang-1）在促進腫瘤新生血管形成、降解周圍基質和腫瘤細胞遷移過程中發揮重要作用，被視為腫瘤基因治療的重要靶點[2]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻礙特定基因轉錄來抑制基因表達。本研究利用RNAi技術沉默人胃腺癌細胞株BGC-823中Ang-1的表達，從多角度觀察其對胃腺癌細胞侵襲性的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃腺癌細胞株BGC-823購自中科院上海生物細胞研究所；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養基、胰蛋白酶、Transwell培養皿購自美國Gibco公司；山羊抗人整合素β1抗體和兔抗人CD44V6抗體購自美國SANTA公司；兔抗人Ang-1抗體和免疫熒光檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與siRNA轉染 胃腺癌細胞株BGC-823在含10％胎牛血清的DMEM培養基中培養，培養液中加入100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素。每4～5 d傳代1次。取生長狀態良好的BGC-823細胞隨機分為對照組和實驗組，對照組轉染siRNA-Cotrol，實驗組轉染siRNA-Ang-1，分別將siRNA-Cotrol和siRNA-Ang-1與Lipofectamine 2000在無血清DMEM中輕柔混合后靜置20 min備用，用DMEM漂洗2次，加入Lipofectamine 2000-siRNA復合物，37℃、5％CO2細胞培養箱培養6 h，加入胎牛血清終止轉染。Ang-1的siRNA靶序列為：5′-GCGATCCTTAGCACACTTGTAA-3′（登記號：AB009873），由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR檢測Ang-1 mRNA表達 采用Trizol試劑一步法提取細胞總RNA，用分光光度計驗證RNA純度；逆轉錄為cDNA，以β-actin為內參進行PCR擴增。Ang-1引物：上游為5′-CAACGGTTGACTGGCTG-3′，下游為5′-GAATCGGTCTAAGACC-3′，擴增產物大小為193 bp；β-actin引物：上游為5′-GGCTGGGTTTCTGCTACGCT-3′，下游為5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′，擴增產物大小為357 bp。反應參數：94℃預變性5 min，然后94℃50 s，56℃45 s，72℃45 s，共32個循環，再72℃延伸5 min；PCR產物于2％瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統掃描成像，紫外燈下觀察電泳條帶，求得每個待測產物與β-actin產物吸光度（A）值之比，進行半定量分析。

1.2.3 Western Blot檢測整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表達 提取總蛋白，Bradford法蛋白定量。PAGE電泳，考馬斯亮藍染色蛋白分離滿意，將蛋白轉到PVDF膜上，Western封閉液封閉，滴加抗體4℃水平搖床過夜，各抗體稀釋度為整合素β1（1∶1 000）、CD44V6（1∶1 500）、Ang-1（1∶500），次日加入辣根酶標記二抗。化學發光試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統掃描化學發光光密度值，Quantity One軟件分析。

1.2.4 細胞免疫熒光檢測整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白定位 轉染前進行細胞爬片，3％H2O2消除過氧化物酶，山羊血清封閉30 min，加入一抗4℃過夜，各抗體稀釋度為整合素β1（1∶1 000）、CD44V6（1∶1 500）、Ang-1（1∶500），加入羅丹明或綠色熒光素酶標記二抗（1∶200），hoechst 33258復染，封片后鏡下觀察。

1.2.5 細胞黏附試驗 纖黏蛋白基底以50μL/孔包被96孔板，4℃過夜。胎牛血清白蛋白作為對照。0.25％胰蛋白酶消化細胞制成單細胞懸液，濃度為1×105/mL，每孔100μL，37℃培養1 h。用磷酸鹽緩沖液輕柔洗去未黏附細胞，加入無血清DMEM培養液150μL，MTT液50μL，37℃培養4 h，每孔加入二甲基亞砜原液100μL，酶聯免疫檢測儀上測定各孔570 nm波長處A值，按以下公式計算出黏附率：黏附率=（實驗組細胞A570值/對照組細胞A570值－1）×100％。

1.2.6 細胞侵襲實驗 在Transwell上室的聚碳酸酯膜上加入Matrigel基質膠60 μL，37℃、30 min使基質膠凝固；將轉染與未轉染Ang-1 siRNA的BGC-823細胞按104個細胞/孔接種于Transwell上室，下室加入600 μL含10％胎牛血清的DMEM培養基。48 h后取出上室，濕棉簽拭去膜表面未穿過膜的細胞，蘇木素染色后封片。倒置顯微鏡下觀察并計數穿過膜的細胞數。

1.3 統計學方法 應用SPSS 16.0軟件對所有數據進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ang-1 mRNA表達 siRNA-Ang-1轉染24 h后，BGC-823細胞表達的Ang-1 mRNA水平明顯降低，至第48 h后開始持續在較低水平，但至72 h后又逐漸升高，見圖1。

Fig.1 Ang-1 mRNA transcription after siRNA-Ang-1 transfection圖1 siRNA-Ang-1轉染后Ang-1 mRNA表達電泳圖

2.2 整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表達 提取的細胞總蛋白的時間點選在siRNA轉染后48 h進行，實驗組中整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表達水平較對照組降低，見圖2。

Fig.2 Expression of invasion related protein in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group圖2 Western Blot檢測2組細胞侵襲相關蛋白表達

2.3 細胞免疫熒光結果 整合素β1、CD44V6和Ang-1主要表達于細胞漿和細胞膜部位，siRNAAng-1轉染48 h后，上述各蛋白質對應的熒光強度均有明顯降低，見圖3。

2.4 細胞黏附及侵襲能力比較 對照組BGC-823細胞黏附率為（74.67±12.44）％，高于實驗組的（30.34±7.27）％，（t=8.702，P＜0.05）。實驗組從Transwell上室向下室遷移的細胞數量（17.29± 4.73）％，較對照組（45.71±9.13）％明顯減少（t=7.818，P＜0.05），見圖4。

3 討論

胃癌是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，當前臨床多采用以手術為主，聯合放、化療等的綜合措施予以治療，但晚期胃癌患者術后5年生存率仍不足15％[3]。研究表明，胃癌的侵襲生長特性與瘤細胞的無控性增殖、周圍基質降解、細胞黏附力增強及新生血管形成等有關[4]。通過基因干預手段影響上述分子事件發生和進展，對于降低癌細胞侵襲性，延長患者生命，爭取手術最佳切除或二次手術機會有重要意義。

3.1 RNAi的作用及機制 RNAi是細胞本身固有的對抗外源基因及其侵害的一種自我保護現象，是雙鏈RNA(dsRNA)分子在mRNA水平關閉相應序列及基因的表達使其沉默的過程。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的dsRNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默[5]。RNAi具有高效性、高特異性、高穩定性和高穿透性等特點[6]。RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持。本研究針對Ang-1進行RNA干擾治療，觀察其對胃腺癌細胞侵襲性的影響。

3.2 Ang-1在胃癌細胞中的作用及機制 Ang-1是血管內皮細胞上酪氨酸激酶受體家族Tie2受體的配體，和血管表皮生長因子不同，Ang-1和Tie2受體的結合并不促進血管內皮細胞的增殖，而是通過調節內皮細胞與周圍間質細胞的相互作用而發揮維持血管穩定、促進新生血管成熟化的作用。阻斷Ang-1 和Tie2受體的結合可以發現腫瘤內新生血管內皮細胞和周圍間質細胞缺乏緊密連接，血管分支不足且不能形成完整的管狀結構[7]。細胞運動是腫瘤轉移的基本條件，在整合素β家族中以整合素β1與胃癌轉移關系最為密切，其介導細胞與細胞、細胞與基質之間的反應，參與細胞黏附和遷移等多個生理過程。新近研究發現，整合素β1也可作為受體與Ang-1結合，介導Ang-1的促黏附作用[8]。CD44V屬于另一類黏附分子家族，分為CD44V（1～10）10種亞型，與透明質酸等配體結合，介導細胞與細胞、細胞與基質之間的黏附功能。陳慧娟等[9]研究發現Ang-l能明顯提高人胃癌細胞BGC-823中整合素β1、 CD44V6的mRNA水平，從而促進腫瘤細胞的黏附和轉移。本研究通過siRNA技術有效沉默了Ang-1 mRNA及蛋白水平的表達，并檢測了其對整合素β1 和CD44V6的表達影響，結果顯示經有效沉默人胃腺癌細胞株BGC-823中Ang-1的表達后，整合素β1 和CD44V6的表達水平發生同向性降低，提示Ang-1可能通過直接或間接協同作用，與整合素β1和CD44V6一起參與胃癌細胞的侵襲和轉移過程，而靶向Ang-1的siRNA技術可有效抑制該惡性表型。

本實驗所選用的Transwell雙室培養皿的濾膜孔徑為8 μm，由于膜孔被Matrigel覆蓋，細胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動穿過這種鋪有Martrigel的濾膜。以上兩種材料的結合應用已成為當前研究腫瘤細胞侵襲和遷移能力的重要工具。本研究通過沉默人胃腺癌細胞株BGC-823中Ang-1的表達，發現該細胞系的侵襲和遷移能力明顯降低。接下來課題組將嘗試將這一技術在動物荷瘤鼠模型中加以驗證。

Fig.3 The subcellular localization of invasion-related protein in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group shown by cell Immunofluorescence(×400)圖3 2組中侵襲相關蛋白的細胞定位表達(×400)

Fig.4 Cell migration and invasion were assessed using transwell migration and invasion assays in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group(×200)圖4 Transwell檢測2組腫瘤細胞的遷移能力(×200)

[1]Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646-674.doi:10.1016/j.cell.2011.02. 013.

[2]Fagiani E,Christofori G.Angiopoietins in angiogenesis[J].Cancer Lett,2013,328(1):18-26.doi:10.1016/j.canlet.2012.08.018.

[3]Orditura M,Galizia G,Sforza V.Treatment of gastric cancer[J]. World J Gastroenterol，2014，20(7):1635-1649.doi:10.3748/wjg. v20.i7.1635.

[4]Gu X,Xing X,Yang W,et al.High expression of integrin-linked kinase predicts aggressiveness and poor prognosis in patients with gastric cancer[J].Acta Histochem，2014，Feb 3.pii:S0065-1281 (14)00019-1.doi:10.1016/j.acthis.2014.01.005.[Epub ahead of print]

[5]Chen Y,Huang L.Tumor-targeted delivery of siRNA by non-viral vector:safe and effective cancer therapy[J].Expert Opin Drug Deliv,2008,5(12):1301-1311.doi:10.1517/17425240802568505.

[6]Wu K,Nie Y,Guo C,et al.Molecular basis of therapeutic approaches to gastric cancer[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(1):37-41. doi:10.1111/j.1440-1746.2008.05753.x.

[7]Karamysheva AF.Mechanisms of angiogenesis[J].Biochemistry (Mosc),2008,73(7):751-562.

[8]Wykosky J,Fenton T,Furnari F,et al.Therapeutic targeting of epidermal growth factor receptor in human cancer:successes and limitations[J].Chin J Cancer,2011,30(1):5-12.

[9]陳慧娟,歐希龍,孫為豪,等.促血管生成素-1對人胃癌細胞黏附和轉移作用的研究[J].醫學研究生學報,2009,22(2):126-130.

（2013-09-03收稿 2014-03-13修回）

（本文編輯 李鵬）

Study of Reversing Invasion of Human Gastric Cancer Cell Line BGC-823 by Targeting Angiopoietin-1 Using siRNA

XING Yuxin1，WANG Wei2，SANG Xianmin2，ZHAO Yuanshun3，ZHANG Chunze4
1 Department of General Surgery,Tianjin Occupational Prevention and Treatment Hospital＆Tianjin Worker’s Hospital, Tianjin 300011,China；2 Department of Anus＆Intestine Surgery,Tianjin Dagang Oil Field General Hospital；3 Department of Hepatobiliary Surgery and Liver Transplantation Center,Beijing YouAn Hospital,Capital Medical University；4 Department of Anus＆Intestine Surgery,Tianjin People’s Hospital ZHANG Chunze,E-mail:zhangchunzetj@163.com

ObjectiveTo knock down angiopoietin-1 expression in human gastric cancer cell line BGC-823 and to observe its effect of reversing tumor invasion.MethodssiRNA sequence fragments was designed to target angiopoietin-1 and transferred into human gastric cancer cell line BGC-823.RT-PCR was used to assess the transcription level of angiopoietin-1 mRNA,then western blot and immunofluorescence were used to examine the expression level of three invasion-associated proteins include integrin β1,CD44V6 and Ang-1.Cell adhesion ability was evaluated by cell adhesion assay and cell invation was determined by matrigel and transwell plastic dual-chamber culture system.ResultsAng-1 mRNA was knocked down by siRNA showed by RT-PCR.The expression of integrin β1,CD44V6 and Ang-1 were significantly lower than control group（P＜0.05）,so did the cellular adhesion and invasion abilities（P＜0.05）.ConclusionKnocking down angiopoietin-1 by siRNA can reverse invasion of human gastric cancer cell line BGC-823 and may provide new ideas and reference for gene therapy of gastric cancer in the future.

angiopoietin-1；RNA interference；stomach neoplasms；neoplasm invasiveness；antigens,CD29；antigens,CD44

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.005

1天津市職業病防治院，天津市工人醫院普通外科（郵編300011）；2天津海濱人民醫院（大港油田總醫院）肛腸外科；3首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝臟移植中心；4天津市人民醫院肛腸外科

△通訊作者 E-mail:zhangchunzetj@163.com