神經(jīng)纖毛蛋白1、2在大腸癌組織中的表達及意義

徐衛(wèi)國苗 娜孫 紅劉 云張世偉郝小惠

神經(jīng)纖毛蛋白1、2在大腸癌組織中的表達及意義

徐衛(wèi)國1苗 娜1孫 紅2劉 云1張世偉1郝小惠3

目的 探討神經(jīng)纖毛蛋白（NRP）-1、2在大腸癌組織中的表達及其與微血管密度（MVD）的相關性，以揭示NRP-1、2與腫瘤血管生成的關系。方法采用免疫組織化學方法檢測66例大腸癌患者的癌組織、癌旁組織及正常組織中NRP-1、2的表達情況，以CD105標記腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞，計數(shù)MVD值。結(jié)果（1）NRP-1、NRP-2在大腸癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達陽性率分別為71.2％、25.8％、0，及80.3％、15.2％、0，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。（2）MVD在大腸癌組織、癌旁組織及正常組織中的計數(shù)分別為35.682±5.542、14.485±3.301、6.864±1.771，各組相比差異有統(tǒng)計學意義（F=986.654，P＜0.01）。（3）不同年齡、性別、腫瘤的部位及分化程度的患者NRP-1、2的表達差異無統(tǒng)計學意義。腫瘤＞5 cm的患者NRP-1陽性表達率較高，腫瘤侵及漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者NRP-1、2的陽性表達率均較高，不同的Dukes分期患者NRP-1、2陽性表達差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（4）大腸癌患者不同性別、年齡及腫瘤大小、部位和組織分化程度MVD的表達差異無統(tǒng)計學意義，而浸潤到漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期高的患者相關MVD的表達增加(P＜0.01)。（5）大腸癌組織中NRP-1（r=0.599，P＜0.01）、NRP-2（r=0.484，P＜0.01）的表達與MVD計數(shù)均呈正相關關系。結(jié)論NRP-1、2在大腸癌的血管新生中起重要作用，并且與大腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移關系密切。

結(jié)直腸腫瘤；神經(jīng)纖毛蛋白質(zhì)類；免疫組織化學；大腸癌；微血管密度；腫瘤血管生成；血管內(nèi)皮細胞

大腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居高不下，而治療多以手術為主[1]。神經(jīng)纖毛蛋白(Neuropilins,NRPs)為一種非酪氨酸依賴性激酶，是Ⅲ型Sema分子與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族分子共享的一類跨膜非信號傳導受體。其家族包括兩個成員即NRP-1和NRP-2，其中NRP-1主要表達在動脈內(nèi)皮細胞，在腫瘤血管的新生及腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]，而NRP-2主要表達在靜脈及淋巴管內(nèi)皮細胞，可能與腫瘤淋巴管新生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關系密切[3]。本研究前期發(fā)現(xiàn)，NRP-1 mRNA表達水平與大腸癌組織的微血管密度(MVD)呈正相關[4]。本文旨在探討NRP-1和NRP-2在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，及其與臨床病理特征的聯(lián)系和血管轉(zhuǎn)移的相關機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院2011年11月—2013年2月手術切除并經(jīng)病理證實的大腸癌標本66例，包括癌組織、癌旁組織及正常組織。其中男39例，女27例；年齡40～87歲，平均年齡63.5歲，其中≤50歲者11例，＞50歲者55例。所有病例術前均未接受化療、放療、免疫治療及中醫(yī)中藥治療。

1.2 臨床病理特征 66例大腸癌病例中，原發(fā)腫瘤直徑≤5 cm者30例，＞5 cm者36例；腫瘤位于結(jié)腸者45例，位于直腸者21例；腫瘤侵及漿膜以內(nèi)者14例，侵及漿膜及漿膜外者52例；病理分級：高分化癌24例，中低分化癌42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例；腫瘤分期采用Dukes分期標準：A期+B期30例，C期+D期36例。

1.3 試劑來源及實驗方法 SP免疫組織化學試劑盒購于北京中杉金橋公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑及CD105抗體購于北京中杉金橋公司，兔抗人NRP-1蛋白多克隆抗體購于Epitmics公司，鼠抗人NRP-2蛋白多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化染色法檢測NRP-1、2。CD105免疫組化染色，于光鏡100倍視野下尋找微血管分布均勻區(qū)域，后在200倍（每個視野面積為0.785 mm2）視野下選取與周圍腫瘤和結(jié)締組織成份區(qū)別明顯的棕黃染色的內(nèi)皮細胞或細胞叢作為一個血管計數(shù)。記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均數(shù)作為該病例的MVD值[5]。

1.4 染色結(jié)果評定 NRP-1、2以腫瘤細胞的胞漿和胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽性結(jié)果，采用細胞陽性百分率和細胞染色強度得分之和進行其表達的評定[6-7]。每張切片在高倍鏡下隨機讀取5個視野（×400）。（1）陽性細胞數(shù)＜5％為0分，5％～為1分，25％～為2分，＞50％為3分。（2）無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以例（％）表示，采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用Dunnett’s T3法。NRP-1、2的表達評分和MVD值的相關性分析采用Pearson相關性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織中NRP-1、2的表達及與臨床病理參數(shù)的關系 NRP-1、NRP-2在大腸癌組織中可表達于腫瘤細胞胞質(zhì)和胞膜，亦可分別表達于組織中動脈的內(nèi)皮細胞或淋巴管內(nèi)皮細胞（不定義為陽性結(jié)果），呈淡黃至棕黃色顆粒狀，見圖1。66例大腸癌組織中NRP-1陽性表達者為47例（71.2％），癌旁組織陽性表達者為17例（25.8％），正常組織為0例。癌組織中NRP-2陽性表達者為53例（80.3％）；癌旁組織陽性表達者為10例（15.2％），正常組織為0例，NRP-1、2在癌組織的陽性表達率明顯高于其癌旁組織及正常組織的陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2分別為78.452和110.768，均P＜0.01）。不同年齡、性別、腫瘤的部位及分化程度的患者NRP-1、2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。腫瘤＞5 cm的患者NRP-1陽性表達率較高，腫瘤侵及漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者NRP-1、2的陽性表達率均較高，Dukes分期高的患者NRP-1、2陽性表達增加,差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

2.2 MVD計數(shù)與臨床病理參數(shù)的關系 根據(jù)CD105的表達情況，計數(shù)大腸癌組織的MVD值，66例患者大腸癌組織中MVD值為35.682±5.542，明顯高于癌旁組織的 14.485±3.301和正常組織的6.864±1.771(F=986.654，P＜0.05)。大腸癌患者不同性別、年齡及腫瘤大小、部位、組織分化程度MVD的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而浸潤到漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期高的患者相關MVD的表達增加(P＜0.01)，NRP-1陽性表達的大腸癌組織MVD值為36.872±5.648，高于NRP-1陰性表達的32.737±4.067，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.897，P＜0.05）。NRP-2陽性表達的大腸癌組織MVD值為36.396±5.134，高于NRP-2陰性表達的32.796± 6.379，差異也有統(tǒng)計學意義（t=2.174，P＜0.05）,見表1、圖2。

2.3 MVD計數(shù)與NRP-1、NRP-2表達間的相關性分析 大腸癌組織中NRP-1的表達評分與MVD值呈正相關關系（r=0.599，P＜0.01），NRP-2的表達評分與MVD值呈正相關關系（r=0.484，P＜0.01），NRP-1、NRP-2均與大腸癌組織血管新生有關。

Tab.1 Expression of NRP-1,2 in colorectal cancer tissue and correlation of MVD value with its the clinical features and pathological parameters表1 大腸癌組織NRP-1、2的陽性表達及MVD值與臨床特征和病理參數(shù)的關系

3 討論

目前認為惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均依賴于腫瘤組織新生血管的形成，為腫瘤的生長提供所需的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，亦是腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移的重要因素。本文主要從蛋白表達水平探討NRP-1、NRP-2與大腸癌組織新生血管及浸潤轉(zhuǎn)移的關系，結(jié)果顯示大腸癌組織中，NRP-1、NRP-2的蛋白表達水平隨著MVD值的升高而增加，兩者呈正相關關系，并且NRP-1、NRP-2的表達與大腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期有關，因此，NRPs與大腸癌組織血管新生密切相關，還可促進癌組織的侵襲及轉(zhuǎn)移。

NRPs是一種多功能的非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，可與VEGF相互作用既可抑制腫瘤細胞的凋亡，又可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成。最初認為NRPs只表達于神經(jīng)元細胞，近來發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞[8]、胰腺癌細胞[9]中也有NRPs的表達。NRP-1和NRP-2在肺癌患者中過表達。NRP-1的過表達可促使內(nèi)皮細胞的分裂、增殖及轉(zhuǎn)移，誘使腫瘤血管的增殖，對腫瘤的生長、遷徙及腫瘤血管的生成起促進作用。NRP-2也可促進腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移。Xu等[10]發(fā)現(xiàn)肝癌小鼠肝癌細胞NRP-1的表達與MVD呈正相關，提示NRP-1與腫瘤血管生成有關，而抑制NRP-1的表達可以抑制體內(nèi)外肝癌細胞的生長。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1、NRP-2的表達程度與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[11-12]。因此，可針對NRPs的表達對大腸癌患者進行治療。Dhar等[13]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中的血小板生成因子(PDGF-B)-NRP-1信號系統(tǒng)可以通過骨髓間充質(zhì)細胞促進腫瘤血管的新生以及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，因此可以針對NRP-1進行腫瘤抗血管靶向治療。近來有研究發(fā)現(xiàn)，NRP-2也與MVD值密切相關，可促進惡性黑色素瘤的血管新生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[14]。NRP-2還可增加血管和淋巴管內(nèi)皮細胞的生長和遷移，在腫瘤生長方面起重要作用。鑒于NRP-2在腫瘤細胞遷移和浸潤方面的作用，針對NRP-2可提供一個潛在的新方法去抑制胃腸道轉(zhuǎn)移癌患者癌細胞的生長和存活[15]。Stanton等[16]研究發(fā)現(xiàn)NRP-2也可成為癌癥治療的一個新靶點。

本研究結(jié)果表明，NRP-1和NRP-2的過表達與大腸癌的發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關。NRP-1和NRP-2的表達與MVD呈正相關關系，提示NRPs可能參與了腫瘤血管的新生。近年來，NRP-1、NRP-2已成為抗腫瘤血管形成方法治療腫瘤的重要靶點，但患者是否從此類制劑中獲益，及此療法的有效性還有待于進一步研究。

Fig.1 Expression of NRP-1 and NRP-2 in colorectal carcinoma,paraneoplastic tissues and normal tissues(×400)圖1 NRP-1和NRP-2在大腸癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達（×400）

Fig.2 Expression of CD105 in NRP-1,2 positive and NRP-1,2 negative colorectal carcinoma(×200)圖2 NRP-1、2陽性和NRP-1、2陰性大腸癌組織中CD105的表達（×200）

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（2013-12-16收稿 2014-06-02修回）

（本文編輯 魏杰）

Expression and Clinical Significance of Neuropilin-1 and 2 in Colorectal Carcinoma

XU Weiguo1，MIAO Na1,SUN Hong2,LIU Yun1,ZHANG Shiwei1,HAO Xiaohui3
1Department of Surgical Oncology,the Affiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan 063000,China；2Department of Pathology,School of Basci Medicine,Hebei Union University,3Experimental Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo observe the expression of Neuropilin(NRP)-1,2,to calculate micro vessel density(MVD) in colorectal cancer,paraneoplastic tissues,normal tissues,and to investigate the correlation between NRP-1,2 and MVD to understand the role of NRP-1,2 in the process of tumor angiogenesis.MethodsExpression of NRP-1 and NRP-2 were studied by immunohistochemistry in 66 specimens from colorectal cancer,paraneoplastic tissues and normal tissues.MVD was assessed based on CD105 immunohistochical staining.Results(1)The positive expression of NRP-1,2 in colorectal cancer,paraneoplastic tissues,normal tissues were 71.2％,25.8％,0;80.3％,15.2％,0 respectively.There was a statistical difference between them(P＜0.05).(2)The quantity of MVD in colorectal cancer,paraneoplastic tissues and normal tissues were 35.682±5.542,14.485±3.301 and 6.864±1.771 respectively.There was a statistical difference between them(P＜0.05). (3)Expression of NRP-1,2 had a good correlation with the tumor size,infiltrating depth,lymph node metastasis,Dukes staging(P＜0.05),but no correlation was found with the tumor position,histological types,differentiation degree and the gender or age of patients(P＞0.05).(4)The MVD value had no correlation with the gender or age of patients,tumor size,position, histological types(P＞0.05),but had a good correlation with infiltrating depth,lymphatic metastasis and Dukes staging(P＜0.05).(5)There was a positive correlation between NRP-1,2 and MVD value(P＜0.01).ConclusionNRP-1,2 may play an important role in the angiogenesis of the colorectal cancer,and it correlates with the invasion and metastasis of colorectal cancer closely.

colorectal neoplasms;neuropilins;immunohistochemistry;colorectal cancer;micro vessel density；tumor angiogenesis;vascular endothelial cell

R735.3+4

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.011

河北省科技廳資助項目（10276115D）

1河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院腫瘤科（郵編063000）；2河北聯(lián)合大學基礎醫(yī)學院病理學系;3河北聯(lián)合大學實驗研究中心