Ca2+對CcRIPII-2基因轉化寧陽大棗的影響

黃艷艷,羅磊,牛慶霖,,劉峰,翁曼麗,劉靜,馮殿齊*

Ca2+對CcRIPII-2基因轉化寧陽大棗的影響

黃艷艷1,羅磊1,牛慶霖2,1,劉峰2,翁曼麗3,劉靜1,馮殿齊1*

1.泰安市泰山林業科學研究院,山東泰安271000
2.山東農業大學,山東泰安271018
3.中國科學院遺傳與發育生物學研究所,北京100101

本研究應用農桿菌介導的方法，采用L9(34)正交試驗設計，對影響寧陽大棗基因轉化的各項因子進行了分析比較，并著重探索了Ca2+濃度對侵染轉化的影響。結果表明：侵染效率最高的組合為1/2侵染液濃度，20 min侵染時間和0 mg/L Ca2+濃度。Ca2+濃度在提高寧陽大棗基因轉化效率方面沒有明顯促進效果。Ca2+濃度僅對平均分化芽數影響較大，濃度為0 mg/L時，平均分化芽數最多。本試驗共獲得27株轉化苗，試驗轉化效率為33.33%。

農桿菌介導法;香樟核糖體失活蛋白基因;棗瘋病;Ca2+濃度

棗瘋病是我國棗樹的一種嚴重病害，由MLO病毒感染引起[1]。防治方法主要有兩類：一是常規防治方法，二是化學防治方法，但防治效果都不理想[2]。隨著基因工程技術的發展，基因工程已成為現代植物改良育種的有效手段。本試驗針對當地特有優良棗樹品種寧陽大棗（Ningyang Jujube）深受棗瘋病困擾的現實，以自主構建的香樟CcRIP II抗病基因為目的基因，利用該基因產生的對病毒和真菌的廣譜抗性，采用農桿菌介導的方法，使用已建立良好再生體系的優良棗樹品種寧陽大棗組培苗為試驗材料，進行基因轉化試驗。

農桿菌介導法受多重因素的影響。本試驗設立了侵染液濃度，侵染時間與Ca2+濃度3個因素，設計正交試驗。試驗在以往棗樹農桿菌介導試驗的基礎上，將Ca2+的濃度作為一個試驗變量來進行研究，著重探索了Ca2+濃度對農桿菌侵染過程的影響，探索更為高效的農桿菌介導法，以提高當地特有品種寧陽大棗的基因轉化效率，并進一步提高寧陽大棗抗棗瘋病的能力，也為棗樹基因轉化研究和防治棗瘋病做些有益探索。

1 材料與方法

1.1正交試驗設計

表1 L9(34)正交試驗設計表Table 1 Orthogonal experiment design L9(34)

表2 農桿菌基因轉化L9(34)正交試驗設計Table 2 Agrobacterium-mediated gene transformation orthogonal experiment design L9(34)

1.2受體材料

本試驗受體材料為寧陽大棗（Ningyang Jujube）長紅品種，為泰安市泰山林業科學研究院生物技術中心自主培養的組培苗。

1.3基因來源

本研究所采用的香樟核糖體失活蛋白基因CcRIP II，由中國科學院遺傳與發育生物學研究所和泰安市泰山林業科學研究院共同分離克隆。

1.4實驗步驟

1.4.1 預培養取寧陽大棗長紅組培苗為待用材料，選擇生長健壯的莖段作為侵染試材。每個莖段(1 cm左右)至少要保留一對芽，切兩端，平鋪到培養基上。試驗共9個組合，每個組合3瓶。每個組合對應2個對照組，共45瓶。將按試驗設計做好的瓶苗作好標記并注明日期,，暗培養2～6 d。

1.4.2 菌種活化將含有香樟核糖體失活蛋白基因（CcRIP II-2）的農桿菌按150μL:100 mL體積比接種于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEP液體培養基中，在搖床上于28℃，180 r/min條件下培養過夜。菌液OD值：0.4～0.6。

1.4.3 侵染將已預培養的材料取出來，在無菌條件下進行適當刻傷處理（對照組同樣處理），根據正交設計加入相應的侵染液進行侵染。其中原液即為含有CcRIP II-2基因的正常搖菌所得的農桿菌菌液濃度（菌液OD值0.4～0.6）；1/2菌液為含一半CcRIP II-2基因的農桿菌菌液（菌液OD值0.4～0.6）和一半MS母液的混合液體；1/3菌液為含有1/3 CcRIP II-2基因的農桿菌菌液和2/3MS母液的混合液體。在侵染過程中要進行間歇性的搖動。

1.4.4 共培養按試驗設計侵染結束，將材料從侵液中取出放到帶有無菌濾紙的培養皿上，吸干表面菌液，接種在分化培養基上，共27瓶轉化材料和18瓶對照材料，一起暗共培養2 d。

1.4.5 卡那霉素篩選共培養結束，將受體材料和相應的對照材料轉接于含有卡那霉素的篩選培養基上繼續培養。卡那篩選培養基的選擇壓力設定2個不同的梯度：30 mg/L（一篩培養基）、50 mg/L（二篩培養基）。選擇過程為2個周期，每周期依次設置7 d，30 d。選擇培養結束可對初選出的抗性苗進行采樣、提取DNA和進行PCR檢測。

1.5試驗調查

侵染材料轉入卡那霉素一篩培養后開始對轉化材料進行相關指標的調查。分別調查一篩Kan 30 mg/L，二篩Kan 50 mg/L培養基上苗木生長情況數據。

本試驗主要是針對篩選后植物材料的成活率%、每株枯死程度（全部枯死，每株枯死3/5、每株枯死1/5）、平均分化芽數/株、平均新芽高度（cm）等指標進行調查分析。

1.6分子檢測

對經過第二次篩選培養30 d的寧陽大棗轉化苗進行采樣，按試驗組合順序編號。本試驗共獲得81個存活的抗性芽苗，因有的芽苗過小，采樣時只采集到27個株號的組培苗。對這27個號提取DNA并進行PCR擴增檢測。根據所提供的CcRIP II-2基因的序列資料，設計了一對引物：

引物1：5'-TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3'

引物2：5'-TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA–3'

2 結果與分析

2.1第一次卡那霉篩選結果

在共培養結束后，將受體材料莖段轉移至一篩培養基中（卡那霉素濃度為30 mg/L）培養，7 d后對每個組合中的成活苗、枯死苗、每株枯死1/5與每株枯死3/5的莖段所占的比例以及平均新芽高度、平均分化芽數以及生長狀態做了調查統計。見表3。

表3 卡那霉素第一次篩選調查Table 3 The first selection of Kanamycin

根據表3數據，可以直觀看出受體材料一篩培養時的成活率和分化生長情況，見圖1、圖2：

圖1 一篩成活率Fig.1 Survival rate of the first screening culture

圖2 一篩分化生長情況Fig.2 Differential growth of the first screening culture

從圖1可直觀看出，成活苗最多的是組合6（1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度），成活率為68.3%，與成活率最低的組合1（侵染液原液+10 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度）相差30.2%。從受體材料枯死程度看，組合2和組合8枯死枯死程度為3/5的數值最低，不到10%，組合4最高達40%；枯死程度為1/5的組合中，組合1最高，達60%，組合4（1/2侵染液濃度+10 min侵染時間+880 mg/L Ca2+濃度）最低，不到10%。綜合各組合受體材料的成活率表現，成活率差異較大，基本無枯死苗；枯死程度為1/5的和枯死程度為3/5的數量呈相反增減趨勢，這一點從組合3至組合9的趨勢最明顯。因此，最有利于提高受體材料成活率的是組合6（1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度）。

從圖2看出，受體材料生長狀態逐漸增強，組合1、2長勢一般，組合3至組合9長勢穩定增強；分化新芽數量差異不大，每組數量都在1～1.5個之間，組合9最多，為1.4個；各組合的新芽高度都很低，都不到0.5 cm，無明顯生長，這和培養時間短有關。綜合以上分析，一篩培養時，受體材料生長狀況還處于新芽萌發和適應生長階段，較適合新芽萌發的是組合9（1/3侵染液濃度+20 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度）。

根據表3第一次篩選結果，對受體材料成活率、平均新芽高度、平均分化芽數進行極差分析，結果見表4：

表4 第一次篩選培養極差分析Table 4 orthogonal analysis to the first screening culture

由表4分析得出，對成活率影響最大的因素為侵染液濃度，其次為Ca2+濃度，侵染時間影響最小。在各因素中，侵染液濃度以1/2侵染液濃度為最佳，侵染時間以20 min最佳，Ca2+濃度為440 mg/L時最佳。因此成活率最高的組合是：1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度。

對平均新芽高度影響最大的因素為侵染液濃度，其次為侵染時間，影響最小的是Ca2+濃度。得到平均新芽高度最高的組合為：1/3侵染液濃度+10 min侵染時間+880 mg/L Ca2+濃度。

對平均分化芽數影響最大的因素為Ca2+濃度，其次為侵染液濃度，影響最小的是侵染時間。得到平均分化芽數最多的組合為：1/3侵染液濃度+10 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度。

綜合一篩培養直觀分析和極差分析結果，在成活率和新芽分化數量方面基本一致。

2.2第二次卡那霉篩選

在一篩培養結束后，將受體材料莖段轉入二篩培養基（卡那霉素濃度為50 mg/L）繼續培養，30 d后調查每個組合中的成活苗、枯死苗、每株枯死1/5與每株枯死3/5的莖段所占的比例以及平均新芽高度、平均分化芽數、生長量以及生長狀態，結果見表7。

表5 卡那霉素第二次篩選Table 5 The second screening culture of Kanamycin

根據表5數據，可以直觀看出受體材料二篩培養時的成活率和分化生長情況，見圖3、圖4：

圖3 二篩成活率Fig.3 Survival rate of the second screening culture

圖4 二篩分化生長情況Fig.4 Differential growth of the second screening culture

從圖3看出，在二篩培養中變化最明顯的是枯死苗數量顯著增加，呈明顯上升趨勢，組合9枯死率最高，有接近60%的受體材料都枯死了，其次是組合4，枯死率最低的是組合6，不到30%，與最高枯死率相差30%左右；各組合成活苗數量也出現明顯差異，成活率最高的是組合5，為42%，最低的是組合7（1/3侵染液濃度+10 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度），僅19%，兩者相差23%；枯死程度3/5和1/5的表現較一致，枯死率呈現減—增—減的數量整體趨向。綜上，成活苗最多的是組合5（1/2侵染液濃度+15 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度），枯死率最高的是組合9（1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度）。

從圖4看出，二篩受體材料生長狀態呈現前后一般中間較強的特點，組合1、2、3、8、9為同一水平，長勢一般，組合4、5、6、7為同一水平，長勢較強，無明顯突出的組合；各組合分化芽數差異不大，都在1個～1.5個之間，其中組合2最多，為1.5個；各組合生長量差異不大，都在0.5 cm～1.5 cm之間，組合2最大，為1.4 cm，比最小的組合8多0.68 cm；新芽高度差異不顯著，最大的組合7為1.17 cm比最小的組合5高0.65 cm。綜上，除生長狀態外，各組合的新芽高度、分化新芽數量和生長量生長趨勢基本一致，差異幅度都不大。組合2（侵染原液+15 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度）分化芽數最多，生長量最大，組合7（1/3侵染液濃度+10 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度）新芽最高。

根據表5第二次篩選所獲數據進行正交分析，結果見表6。

表6 第二次篩選培養極差分析Table 6 Range analysis to the second screening culture

從表6計算的受體材料成活率、平均新芽高度、平均分化芽數極差結果，得出：

各因素對成活率的影響依次為：侵染液濃度＞Ca2+濃度＞侵染時間。得到成活率最高的組合為：1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度。

各因素對平均新芽高度的影響依次為：侵染液濃度＞侵染時間＞Ca2+濃度。得到平均新芽高度最高的組合為：1/3侵染液濃度+10 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度。

各因素對平均分化芽數的影響依次為：Ca2+濃度＞侵染液濃度＞侵染時間。得到平均分化芽數最多的組合：1/3侵染液濃度+15 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度。

綜合二篩極差分析結果，侵染液濃度對成活率和新芽高度影響最大，Ca2+濃度對分化芽數影響最大。

綜合二篩培養直觀分析和極差分析結果：

影響受體材料成活率和新芽高度最大的因素是侵染液濃度，影響分化芽數最大的因素是Ca2+濃度。

成活率最高的是組合5：1/2侵染液濃度+15 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度；

枯死率最高的是組合9：1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度；

分化芽數最多，生長量最大的是組合2：侵染原液+15 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度；新芽生長最高的是組合7：1/3侵染液濃度+10 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度。

綜合比較一篩和二篩極差分析結果，見表7：

表7 極差分析比較Table 7 Comparison of the range analysis

從表7看出，在一篩培養時，對受體材料成活率和新芽高度影響最大的是侵染液濃度，對分化芽數影響最大的是Ca2+濃度；二篩培養時，對受體材料成活率和新芽分化數影響最大的是Ca2+濃度，侵染液濃度對新芽高度影響較大。綜上，兩次篩選培養中，Ca2+濃度對新芽分化數影響都最大，成活率受侵染液濃度和Ca2+濃度雙重影響，侵染液濃度都是影響新芽高度的最重要因素。

對一篩、二篩的最佳組合進行比較，分析兩次培養的差異，見表8。

表8 最佳組合比較Table 8Aggregate optimum group

綜合分析兩次篩選培養最佳組合，結果基本類似，只略有不同。

Ca2+濃度對兩次篩選培養中受體材料成活率和新芽高度有明顯影響，在侵染液濃度和侵染時間相同情況下，一篩培養的Ca2+濃度比二篩培養的濃度高440 mg/L。在兩次培養中，適合提高成活率的侵染液濃度都是1/2侵染液濃度，侵染時間都是20 min；適合新芽高生長的侵染液濃度都是1/3侵染液濃度，侵染時間都是10 min；

Ca2+濃度對新芽分化數影響不明顯，兩次篩選培養中都是不添加Ca2+時分化芽數最多。侵染時間對兩次篩選的影響差異最大，在侵染液濃度和Ca2+濃度相同情況下，一篩培養選用10 min侵染時間，二篩培養選用15 min侵染時間能分化最多新芽。

本試驗中，根據第二次篩選培養結果，可初步判斷受體材料基因轉化效率，主要以篩選后轉化受體的成活率為標準，所以轉化效率最高的組合為：1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+0 mg/LCa2+濃度。

2.3轉基因植株PCR分子鑒定

圖5 PCR產物電泳圖譜Fig.5 PCR electrophoretogram

由PCR電泳圖可見，檢測的27個株號轉基因植株全部顯示出明顯的陽性目的條帶，而未轉化植株沒有顯示出目的條帶。這初步表明外源香樟核糖體失活蛋白基因已整合到寧陽大棗基因組內。

3 討論

本試驗采用的核糖體失活蛋白基因RIP是一種專一性較強的毒蛋白，可抑制某些蛋白質的生物合成，從而達到提高抗性的目的。RIP的抗性基因工程已在煙草、小麥、玉米、番茄等很多植物中穩定表達，且對相應的病原菌具有一定程度的抗性[3]。因此轉RIP基因工程正發展成為防治植物病蟲害的新途徑[4]。本試驗所采用的CcRIP II-2基因包含了RIP基因的這一特性，通過對寧陽大棗進行農桿菌介導試驗，獲得27個抗性單株，經PCR檢測，初步確定CcRIP II-2基因已經整合到寧陽大棗基因組中。這些抗性單株的獲得，為寧陽大棗抗棗瘋病品種選育和果樹抗性育種研究開辟了一條新途徑。

有研究證明，農桿菌介導的植物基因轉化效率受多個因子的影響，包括農桿菌的株型、質粒的構建、外植體的再生頻率、篩選標記的可靠性，以及轉化過程中外部環境的控制等，其中前幾個因子在轉化方案確定后不會有很大的改變，而轉化的外部環境可以根據實驗操作的需要作出較大的調整，這些調整在提高轉化效率上往往收益顯著[5]。因此，我們把Ca2+作為轉化過程中的一個外部影響因素加以考慮。Ca2+信號通路是植物中信號轉導已確認的主要途徑，它參與了多種生理活動的調節[6]。大量研究表明，Ca2+也參與了植物----微生物互作的信號傳遞[7]。我們推測在農桿菌侵染過程中Ca2+也發揮了重要的作用。

通過試驗分析，發現Ca2+在農桿菌介導法轉化CcRIP II-2基因過程中對受體材料轉化效率確有明顯影響但對促進轉化效率提高作用不明顯，未添加Ca2+的侵染液較添加了不同濃度Ca2+的獲得了較高的轉化率。盡管Ca2+對提高寧陽大棗基因轉化效率促進作用不明顯，但其對寧陽大棗（Ningyang Jujube）受體材料成活率和新芽高度卻有顯著促進作用，這說明，Ca2+作為迄今為止唯一被證實的植物細胞內信號，在植物的生長發育及其對環境的反應和適應中起著十分重要的作用[8]。

另外，Ca2+濃度對新芽分化數也有影響，侵染液中不添加Ca2+時寧陽大棗受體材料分化芽數比添加了Ca2+的要多，說明侵染液中的Ca2+對于受體材料芽組織的分化生長促進作用不明顯。

本試驗中，在篩選培養基中添加不同濃度的卡那霉素，同時為了抑制農桿菌的過度生長對植物受體造成傷害，還添加了抑菌素，這些都對轉化受體材料具有一定毒害作用，也在一定程度上影響了植物材料的正常生長。張和臣等認為，植物對細胞外部的逆境信號需要細胞感受并跨越細胞膜才能把信息輸進細胞，從而誘導相應基因的表達，產生各種生物反應，引起細胞膜滲透壓的增加，進而引起細胞壁間的機械脅迫以及膜的流動性等。植物通過膜的變化誘發植物產生鈣信號并誘發產生由膜外到膜內的信號傳遞過程[9]，因此，受體材料的狀態和生長環境都對試驗結果有影響。

因本試驗樣本較小，對Ca2+濃度的設計梯度有所限制，故Ca2+濃度水平對棗樹基因轉化的確切影響還有待進一步試驗研究，對獲得的轉基因植株的穩定性表現也還需進一步檢測。

4 結論

（1）Ca2+對寧陽大棗基因轉化效率有顯著影響，不添加Ca2+可獲得較高的轉化率。經PCR檢測，本試驗共獲得27個轉化植株，轉化率為33.33%。由此看出，Ca2+對提高寧陽大棗轉化香樟核糖體失活蛋白基因CcRIP II-2轉化效率促進作用不明顯；

（2）Ca2+濃度對寧陽大棗受體材料成活率和新芽高度有明顯影響，在侵染液濃度和侵染時間相同情況下，添加Ca2+范圍在0 mg/L～440 mg/L對轉化受體成活率影響相同，添加Ca2+范圍在440 mg/L～880 mg/L對轉化受體新芽高度影響相同；成活率受侵染液濃度和Ca2+濃度雙重影響，侵染液濃度是影響新芽高度的最重要因素；

（3）Ca2+濃度對新芽分化數有顯著影響，侵染液中不添加Ca2+時寧陽大棗受體材料分化芽數最多；

（4）影響受體材料成活率和新芽高度最大的因素是侵染液濃度，影響分化芽數最大的因素是Ca2+濃度；（5）添加Ca2+的寧陽大棗（Ningyang Jujube）抗MLO病毒基因轉化試驗最佳組合為：效率最高的組合：1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+0 mg/LCa2+濃度；成活率最高的組合：1/2侵染液濃度+15 min侵染時間+0 mg/L Ca2+濃度；枯死率最高的組合：1/2侵染液濃度+20 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度；分化芽數最多，生長量最大的組合：侵染原液+15 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度；新芽生長最高的是組合7:1/3侵染液濃度+10 min侵染時間+440 mg/L Ca2+濃度。

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Effect of Ca2+on CcRIP II-2 Gene Transformation of Ningyang Jujube

HUANG Yan-yan1,LUO Lei1,NIU Qing-lin2,1,LIU Feng2,WENG Man-li3, LIU Jing1,FENG Dian-qi1*
1.Taishan Institute of Forestry Science,Tai'an271000,China
2.Shandong Agricultural University,Tai'an271018,China
3.Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

In this study,the concentration effect of Ca2+on transformation ofRIPgene(Ribosome Inactivating Protein Gene) cloned fromCinnamomum camphoratoNingyang Jujube was investigated in detail with L9(34)orthogonal design,through the analysis of factors which affected the transformation.The results showed that the concentration of Ca2+had no crucial effect on transformation and the best combination was the bacterium solution with 0.4-0.6 OD value was double diluted,20-minutes infection and without Ca2+.27 transformation seedlings were obtained and the transformation rate was 33.33%.

Agrobacterium-mediated transformation;Cinnamomum camphoraL.Ribosome-inactivating protein(RIP); Jujube Witches Broom;Ca2+concentration

S722.3文獻標示碼:A

1000-2324(2014)04-0481-08

2012-10-18

2013-03-12

抗棗瘋病植原體(MLO)基因轉化項目

黃艷艷(1978-),女,工程師,主要從事林果花卉生物技術研究.E-mail:Yanhuang0321@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:fengdianqi@163.com