高溫與干旱脅迫對匍匐翦股穎抗氧化代謝的影響

曲亞楠,楊志民

高溫與干旱脅迫對匍匐翦股穎抗氧化代謝的影響

曲亞楠1,楊志民2*

1.南京農業大學園藝學院,江蘇南京210095
2.南京農業大學草業學院,江蘇南京210095

以冷季型草坪草匍匐翦股穎(Agrostis stolonifera L.)L-93為材料，在人工氣候箱內對L-93進行短期（9 d）高溫、干旱以及高溫干旱復合脅迫處理，研究不同脅迫處理對葉片相對含水量（RWC）、相對電導率（EL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性以及丙二醛（MDA）含量的影響。結果表明，在不同脅迫處理下，L-93葉片SOD活性均出現先上升后下降的趨勢；POD、CAT和APX活性隨處理時間的延長而降低。雙重脅迫對植株抗氧化酶系統造成的傷害最為嚴重，短時間內造成植物體內MDA含量與EL值的迅速上升。

抗氧化酶系統;匍匐翦股穎;雙重脅迫;高溫;干旱

匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera L.）為禾本科翦股穎屬多年生草本植物，作為常見的冷季型草坪草，廣泛應用于園林綠化與運動場建設[1,2]。作為開放環境下的植物體系，草坪草在生長的過程中往往會面臨多種環境因子的脅迫。匍匐翦股穎屬于C3植物[3]，綠期長、耐寒性較強，耐熱性較差；其耐旱性與多年生黑麥草等冷季型草坪草相比較差。在我國氣候過渡地區，夏季持續高溫，降水不均，溫度和水分條件的不適宜成為該草坪草種在這一地區生長的主要限制因素[4]。

近年來，已有一些高溫干旱雙重脅迫對草坪影響的報道[5,6]。萬里強等[7]選取多年生黑麥草作為試驗材料，觀察了葉綠體和線粒體超微結構的變化，結果顯示，耐熱抗旱性較強的品種葉綠體受損程度較輕。劉曉軍等[8]以葦狀羊茅為材料，研究了干熱脅迫下，葦狀羊茅對不同水肥條件的響應機理。目前，關于雙重脅迫對匍匐翦股穎生理生化反應影響的研究較少。本研究利用人工氣候箱模擬干旱與高溫環境，觀察和比較在不同脅迫下，冷季型草坪草匍匐翦股穎葉片相對含水量、相對電導率、丙二醛含量以及抗氧化酶活性的變化規律，為今后的冷季型草坪草抗逆性研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

挖取生長2年的L-93健康草皮塊，種入直徑20 cm，高18 cm的塑料盆里預培養。采用草炭與洗凈的河沙（草炭:沙=2:1）作為盆栽基質。預培養期間，每周施用一次1/2倍的Hoagland's營養液，每3 d澆透水1次，修剪高度5 cm。

1.2試驗處理

試驗設4個處理，分別為對照（CK）、干旱（D）、高溫（H）、高溫+干旱（HD），其中每個處理包括4個重復。材料培養至長勢良好覆蓋均勻一致時，轉入人工氣候箱內適應性生長7 d后開始處理。箱內環境條件設置為：箱內濕度50%，光強12000 lux，光周期12 h。材料處理方法如下：對照（CK）：晝夜溫度25/15℃，每3 d澆水一次，直至容器底部有水分流出；高溫處理（H）：晝夜溫度35/25℃，每3 d澆水一次，每次500 mL/盆；干旱處理(D):晝夜溫度25/15℃，自然干旱，不澆水；高溫+干旱處理（HD）：晝夜溫度35/25℃，自然干旱，不澆水。分別于0 d、3 d、6 d、9 d取樣。

1.3測定指標及方法

1.3.1 葉片相對含水量(RWC)剪取第二葉位新鮮葉片0.2g，wf；將取得的葉片組織浸泡于去離子水中24h，取出用吸水紙擦干表面水分，稱取其飽和重wt；隨后將葉片轉移至80℃烘箱內烘至恒重，冷卻至室溫后稱取其干重，wd[9]。試驗稱量使用天平為Sartorius BSA323S型，量程0～220 g，精度0.001 g。相對含水量=（wf—wd）/（wt—wd）*100%

1.3.2 葉片相對電導率(EL)采取相對電導率法[10]，取第二葉位新鮮葉片0.2 g，浸泡于裝有去離子水的50mL離心管中，震蕩24h后測定電導率值，E0；隨后將離心管放入水浴中，煮沸后測定電導率值，Eb。相對電導率=E0/Eb*100%。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量丙二醛（MDA）含量測定，采用李合生的巴比妥酸（TBA）顯色法測定[10]。

1.3.4 抗氧化物酶活性取葉片0.5g，加入液氮研磨成粉末狀后溶解于4mL磷酸緩沖液（pH 7.8,0.05 mol/L），在4℃、12000 r/min下離心20 min，得到的上清液放入4℃條件下保存，用于測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性。

SOD活性采取氮藍四唑（NBT）還原法測定[11]：取50 μL酶液，加入混合反應液含0.05 mol/L磷酸緩沖液、0.13 mol/L Met溶液、750 μmol/LNBT溶液、100 μmol/LEDTA-Na2溶液、20 μmol/L核黃素溶液，以不加酶液作為對照，測量560 nm處的吸光值。

POD活性通過愈創木酚法測定[10]：取40 μL酶液，加入反應液含50 mL 0.2 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液、28 μL磷愈創木酚、19 μL 30%H2O2溶液，以磷酸緩沖液作對照，測量470 nm處的吸光值。

CAT活性的測定[6]：取0.1 mL酶液，加入2.9 mL反應液，以磷酸緩沖液作對照，測定1 min內240 nm處吸光值的變化。反應液中含有100 mL0.05 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液、0.1546 mL 30%H2O2溶液。

APX活性的測定[12,13]：取0.1 mL酶液，加入2.6 mL含0.1 mmol/L EDTA-Na2的磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）、0.15 mL 15 mmol/L的抗壞血酸溶液、0.1 mL 20 mmol/L的H2O2溶液，測量290 nm處吸光值在1 min內的變化[10]。

試驗測定使用的紫外分光光度計為美國通用GE Ultrospec 9000型。

1.4試驗數據處理

以不同的處理條件作為變量，采用SPSS13.0對試驗數據進行單因素的方差分析，利用LSD法檢驗差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1葉片相對含水量的變化

葉片相對含水量（RWC）用于衡量植物體內的水分狀況。如圖1所示，干旱處理3～6 d，葉片含水量下降至46.2%，與對照相比差異顯著（P＜0.05）；高溫脅迫下，L-93葉片RWC下降時間較晚，處理9 d時由97%下降到27%。高溫干旱復合脅迫3 d條件下，L-93葉片RWC與對照相比下降趨勢顯著，由0 d 94%降低至15%；處理3～9 d，L-93葉片RWC下降趨勢減緩。

結果表明，受不同脅迫影響，L-93葉片RWC呈明顯下降趨勢。處理9 d條件下，L-93葉片RWC由高到低依次是：對照處理、高溫處理、干旱處理、雙重脅迫處理。

2.2葉片相對電導率

圖1 不同脅迫對葉片相對含水量的影響(CK:對照;D:干旱;H:高溫;HD:高溫+干旱)Fig.1 Relative water content was affected by drought(D), heat(H)and combined stresses(HD)in leaves of‘L-93'

圖2 不同脅迫對葉片相對電導率的影響(CK:對照;D:干旱;H:高溫;HD:高溫+干旱）)Fig.2 Electrolyte leakage was affected by drought(D),heat(H) and combined stresses(HD)in leaves of creeping bentgrass

高溫或干旱會引起植物細胞膜的功能損傷，葉片相對電導率（EL）可以說明植物葉片細胞膜的受損程度[14]。圖2表明，在處理3～6d期間，干旱處理的EL值從37.1%顯著增加至82.8%。高溫處理0～6 d，L-93葉片EL值上升緩慢；處理6 d后葉片EL值升高速度明顯加快。高溫干旱脅迫下葉片EL值升高速度明顯高于其他處理，并在處理6d后趨于穩定。處理第9 d，高溫干旱處理與干旱處理下L-93葉片EL值無顯著差異。

結果表明，受不同脅迫影響，L93葉片EL值與對照相比均呈明顯的上升趨勢；不同處理間L-93葉片EL值上升幅度存在顯著；高溫脅迫對L-93葉片細胞膜穩定性造成的影響最小。

2.3丙二醛含量

丙二醛（MDA）含量的變化是判斷植物細胞膜脂過氧化程度的重要指標。如圖3所示，干旱處理0～3 d期間，L-93 MDA含量與對照相比沒有顯著差異；處理3～9 d，L-93葉片MDA含量由2.7 mmol/mg·FW上升至16.2 mmol/mg·FW，與對照相比差異顯著。受高溫脅迫影響，L-93葉片MDA含量出現明顯上升趨勢的時間較晚；脅迫6～9 d，L-93 MDA含量由2.7 mmol/mg·FW上升至15.5 mmol/mg·FW。在高溫干旱復合脅迫下，L-93葉片中MDA上升趨勢顯著，由0 d條件下的2.6 mmol/mg·FW上升至9 d的50.8 mmol/mg·FW。

圖3 不同脅迫對丙二醛（MDA）含量的影響（CK:對照;D:干旱;H:高溫;HD:高溫+干旱）Fig.3 MDAwas affected by drought(D),heat(H) and combined stresses(HD)in leaves of‘L-93’

圖4 不同脅迫對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響（CK:對照;D:干旱;H:高溫;HD:高溫+干旱）Fig.4 SOD activity in‘L-93'in response to drought (D),heat(H)and combined stresses(HD)

結果表明，受高溫或干旱脅迫影響，L-93葉片中MDA含量的變化沒有顯著差異（P＞0.05）。高溫干旱雙重脅迫下，MDA含量上升幅度顯著高于其他處理。

2.4葉片抗氧化酶活性

如圖4所示，受脅迫影響，不同處理L-93葉片中SOD活性呈明顯的先上升后下降的趨勢。處理0～3 d，L-93葉片SOD活性由高到低依次是高溫干旱復合脅迫、干旱脅迫、高溫脅迫和對照處理，不同處理間L-93葉片SOD活性存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖5可以看出，與對照處理相比，不同脅迫條件下L-93葉片POD活性均隨處理時間的增加呈降低趨勢。處理3 d，受高溫干旱雙重脅迫影響，L-93葉片POD活性下降幅度最大，由22.1 μmol-1.mg-1.protein下降至10.9 μmol-1.mg-1.protein。與其他處理相比存在顯著差異（P＜0.05）。處理0～6 d，高溫脅迫和干旱脅迫處理的L-93葉片POD活性變化趨勢一致，處理間差異不顯著（P＞0.05）。處理9 d，L-93受雙重脅迫與高溫脅迫影響，其葉片POD活性差異不顯著。

圖5 不同脅迫對過氧化物酶（POD）活性的影響（CK:對照;D:干旱;H:高溫;HD:高溫+干旱）Fig.5 POD activity in‘L-93'in response to drought (D),heat(H)and combined stresses(HD)

圖6 不同脅迫對過氧化氫酶（CAT）活性的影響（CK:對照;D:干旱;H:高溫;HD:高溫+干旱）Fig.6 CAT activity in‘L-93'in response to drought (D),heat(H)and combined stresses(HD)

由圖6可以看出，L-93葉片CAT活性隨脅迫時間的延長呈逐漸降低的趨勢。處理3～9 d期間，與干旱脅迫相比，高溫脅迫對L-93葉片CAT活性影響不顯著。雙重脅迫造成的L-93葉片CAT活性下降幅度最大，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05）。

圖7表明，受高溫脅迫影響，L-93葉片APX活性呈先上升后下降的趨勢；高溫處理第3 d，L-93葉片APX活性與對照相比沒有顯著差異（P＞0.05）。L-93葉片APX活性受干旱脅迫影響呈持續降低的趨勢；干旱處理3～9 d，APX活性顯著低于對照處理。L-93受雙重脅迫影響，葉片APX活性下降幅度最大，由0 d條件下的19.6μmol-1.mg-1.protein降低至9 d的5.1 μmol-1.mg-1.protein。處理9 d條件下，葉片APX活性由高到低依次是對照、高溫處理、干旱處理、雙重脅迫處理，處理間差異顯著（P＜0.05）。

圖7 不同脅迫對抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的影響（CK:對照;D:干旱;H:高溫;HD:高溫+干旱）Fig.7APX activity in‘L-93'in response to drought(D),heat(H)and combined stresses(HD)

3 討論

葉片組織內水分狀況的穩定有利于維持植物體內正常生理生化反應的運行[15]。Yiwei等[13]對冷季型草坪草耐熱性與抗旱性的研究認為，高溫與干旱會引起植物葉片短時間內蒸騰作用加強，在造成細胞脫水的同時對葉片表面起到一定的降溫保護作用；而持續的高溫和干旱會導致膜脂過氧化反應的發生。本研究結果表明，在高溫、干旱以及雙重脅迫影響下，L-93葉片RWC較對照均顯著降低。L-93受單一干旱脅迫影響，葉片RWC下降幅度顯著高于高溫處理。L-93葉片水分對干旱脅迫的響應更敏感。高溫處理下的L-93能較長時間保證葉片相對含水量的穩定，延緩了脅迫對其它生理結構造成傷害。

植物細胞膜系統的穩定性對于維持逆境下的細胞結構與功能的完整性有著重要的作用[14]。研究表明，植物葉片EL值的變化可以反映細胞膜受損的程度[16,17]。在高溫干旱脅迫下，L-93葉片EL值急劇上升，說明植株細胞膜透性在高溫與干旱的雙重影響下穩定性遭到嚴重損壞，而在單一高溫或干旱脅迫的影響下，L-93葉片EL值升高幅度減小，單一脅迫對其細胞膜透性的影響要顯著弱于雙重脅迫。匍匐翦股穎L-93葉片相對電導率的變化趨勢與MDA含量的變化較為一致。

植物遭受逆境脅迫時，體內活性氧的積累會造成細胞傷害甚至死亡[18]。逆境下植物維持體內抗氧化酶活性的能力是影響其生存的重要因素之一[19]。SOD在植物體內的主要作用是催化活性氧分解形成H2O2與O2[11,20]。逆境脅迫下，植物組織中活性氧含量的上升會誘導SOD活性增強。本研究結果表明，0～3 d的各脅迫對葉片SOD活性起到了顯著誘導作用。在高溫干旱雙重脅迫條件下，SOD活性變化最明顯。分析認為，雙重脅迫下L-93葉片SOD活性的變化可能與葉片中活性氧含量的上升有關。處理3～9 d，受干旱脅迫與雙重脅迫影響，L-93葉片SOD活性的快速下降與植物光合作用減弱或酶降解有關。

POD主要用來催化H2O2與酚類的反應，同時與CAT共同作用催化H2O2形成水，從而有效減少活性氧的積累[21,22]。CAT在植物體內的主要作用是清除H2O2，防止植株衰老[23]。本研究結果表明，L-93葉片POD與CAT活性對高溫與干旱脅迫的響應較為敏感；處理開始后，兩種酶的活性快速下降。APX作為植物葉綠體抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環的關鍵酶，可以有效清除葉綠體內的H2O2[12]。處理9 d條件下，L-93葉片APX活性與對照相比下降明顯。POD、CAT與APX活性的下降會引起細胞中H2O2含量的上升，從而造成葉綠素含量降低與細胞脂質過氧化，嚴重時會導致植物細胞死亡。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終產物，其含量可以用于衡量草坪草所受逆境脅迫的程度[24]。大量的MDA積累會造成膜系統損傷，加深逆境對植株造成的傷害[16]。在不同脅迫的影響下，L-93葉片內MDA含量均迅速上升；處理3～9 d期間，各處理L-93葉片中SOD、POD、CAT與APX活性呈顯著下降趨勢，分析認為過氧化物清除系統的功能損傷是造成MDA含量增加的主要原因。由于相對較高水平的RWC與抗氧化酶活性，L-93葉片MDA含量受單一高溫或干旱脅迫影響上升幅度小于雙重脅迫。

綜上所述，高溫、干旱與雙重脅迫會造成匍匐翦股穎L-93葉片中抗氧化酶活性的降低與過氧化物含量的上升。由于葉片RWC的迅速降低，在雙重脅迫條件下，匍匐翦股穎L-93葉片中MDA與EL值的上升幅度顯著高于單一脅迫造成的影響。

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Effect of Drought and Heat Stress onAntioxidant Metabolism of Agrostis stolonifera L.

QU Ya-nan1,YANG Zhi-min2*
1.Nanjing Agricultural University,College of Horticulture,Nanjing 210095,China
2.Nanjing Agricultural University,College of Agro-grass Science,Nanjing 210095,China

The experiment was designed to investigate drought,heat and combined stresses(9 days,short term)on cool season turf grass Agrostis stolonifera‘L-93'by analyzing leaf relative water content（RWC）,malondialdehyde(MDA), electrolyte leakage(EL)and activity of four anti-oxidant enzymes.Transient increases in superoxide dismutase(SOD)and decreases in catalase(CAT),peroxidase(POD)and ascrobate peroxidase(APX)occurred in drought,heat and combined stress.It took the shortest time for the drought-heat combined stress to cause the damage on creeping bentgrass with quick increase in both malondialdehyde content and the electrolyte leakage.

Anti-oxidant enzymes;creeping bentgrass;combined stresses;heat-drought

S688.4

A

1000-2324(2014)04-0489-06

2013-02-11

2013-04-20

曲亞楠(1988-),男,碩士研究生,主要從事草坪草抗逆生理研究.E-mail:rocatics@126.com

*通訊作者:Author for correspondence.Email:nauyzm@njau.edu.cn