蛹蟲草栽培中幾種細菌性病原菌分離與鑒定*

張園園

(安康市農業科學研究所，陜西 安康 725021)

蛹蟲草栽培中幾種細菌性病原菌分離與鑒定*

張園園

(安康市農業科學研究所，陜西 安康 725021)

利用16S rDNA序列分析的方法，結合細菌形態特征及細菌生理生化鑒定，研究了蛹蟲草栽培過程中易導致病害的3種細菌。結果表明，病原菌株E1與Flavobacteriumchungangense，E2與Flavobacteriumchungangense，E3與Janthinobacteriumlividum的進化距離較小，同源性較高，初步確定分別與其同種。這對蛹蟲草常見病害的防治研究具有重要的指導意義。

蛹蟲草；細菌性病原菌；分離；鑒定

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬蟲夏草，簡稱北蟲草，屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、核菌綱(Pyrenomycetes)、麥角菌目(Clavicipitales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)真菌，與冬蟲夏草(Cordycepssineisis)同屬異種，具有很高的營養價值和藥用價值[1]。大量研究表明，蛹蟲草中所含的活性成分蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等含量明顯高于冬蟲夏草，對提高人體免疫力，預防和治療高血糖、高血壓等多種疾病有顯著的作用[2]。因此，對蛹蟲草的開發研究越來越受到人們的重視。近年來，隨著對蛹蟲草的深入研究，蛹蟲草栽培技術已日趨成熟，但在生產中仍會出現菌絲生長緩慢、子座分化不整齊或不分化及培養基有黏稠狀液體等現象，對蛹蟲草產量影響較大。因此，本試驗就引起以上現象的病原菌進行分離與鑒定，以期為蛹蟲草常見病害的防治研究提供依據，也為完善蛹蟲草的栽培技術提供參考。

1 材料

1.1 樣品采集

分別采集在蛹蟲草栽培過程中被細菌污染的樣品4份。

1.2 培養基

細菌培養基(固體)：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉3 g、瓊脂粉12 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

細菌培養基(液體)：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉3 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離純化

采用平板稀釋涂布法，對樣品進行分離純化。將4份樣品分別加入裝有100 mL無菌水的三角瓶中，在30℃、200 r·min-1的條件下震蕩10 min，按10倍梯度稀釋法得到10-6倍～10-8倍稀釋液。各取0.5 mL稀釋液均勻涂布于平板上，每個梯度重復3次，將平板置于(25±1)℃條件下倒置培養，待平板長出菌落后，分別挑取單菌落進行劃線分離純化，直至獲得純的菌種，4℃保存待用。

1.3.2 致病性測定

將已分離純化的3個細菌菌株，分別挑取一環細菌置于細菌液體培養基中，30℃培養24 h，制備3種細菌懸浮液。當蛹蟲草菌絲覆面后，分別接種細菌懸浮液10 mL·盒-1，設置無菌水對照。接種后進行常規管理，并觀察蛹蟲草生長情況。

1.3.3 菌落形態觀察

將分離到的細菌菌株分別置于(28±2)℃的培養箱中培養，觀察菌落特征，并進行簡單的染色鏡檢，觀察菌體形態。

1.3.4 細菌生理生化鑒定

挑取細菌菌落，接種生化管，培養24 h～48 h，觀察分離菌株的生化特性。檢測項目包括甲基紅試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、接觸酶試驗、運動性試驗。

1.3.5 菌株分子生物學鑒定

采用16S rDNA法對細菌進行分子生物學鑒定[3]。首先，采用快速微量提取法提取細菌基因組DNA，并將各菌株的DNA溶解于50 μL的TE中，-20℃保存備用；其次，采用細菌通用引物27F和1492R進行擴增，正向引物：27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)，反向引物：1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)。PCR反應體系(50 μL) 27F 2 μL，1492R 2 μL，ExTaq 0.4 μL，2×Reaction mix 25 μL，ddH2O20.6 μL，DNA 2 μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min，然后95℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個循環，最后72℃延伸10 min；PCR產物經電泳檢測后，由上海桑尼生物科技有限公司進行測序；將各個菌株基因序列運用Blast程序與GenBank中已存在的菌株核酸序列進行比較，選取相似性較高的序列進行分析，使用MEGA5軟件中的BootstrapTest of Phylogeny-Neighbor Joining法構建系統發育樹[4]，并參照菌株的形態特征和生理生化檢測結果，結合常見細菌系統鑒定手冊[5]，初步鑒定菌株的種屬。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化與保藏

根據形態特征從樣品中分離到3種菌株，分別編號為E1～E3。

2.2 致病性測定

致病性測定結果表明，在菌絲覆面后，重新接種3種不同的菌懸液，48 h后菌絲均表現出生長緩慢的現象。培養36 h后對其進行光照，結果如圖1～圖4所示。

圖1～圖4表明，菌株E1～E3均可不同程度地抑制蛹蟲草菌絲生長，導致菌絲生長緩慢、無法正常轉色并形成原基，最終出現菌絲老化并自溶的現象。

2.3 菌株形態觀察

不同菌株菌落形態觀察結果見表1。

2.4 細菌生理生化鑒定

細菌E1～E3的生理生化鑒定結果見表2。

2.5 菌株PCR擴增產物

采用原核生物16S rDNA序列的通用引物27F、1492R對3株細菌基因組DNA進行PCR擴增，產物的瓊脂糖凝膠電泳

表1 菌落形態觀察

結果表明，在1 500 bp處有3條DNA帶，表明分離的菌株均為原核生物類。

表2 細菌的生理生化鑒定結果

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.6 序列比對和進化樹的構建

使用NCBI網站，將E1～E3的序列與數據庫中各個菌株的序列進行比對，并選取相似性較高的序列構建進化樹，結果見表3～表5和圖5～圖7。

2.6.1 E1菌株Blast比對結果及系統發育分析

GenBank 上E1的部分相似菌株及E2系統進化發育樹見表3、圖5。

表3 GenBank上E1的部分相似菌株

由表3可見，E1與Flavobacteriumchungangense的同源性最高，達98%；從圖5可以看出，E1與Flavobacteriumchungangense聚為一支，與其他菌株的差異相對較大。因此，綜合Blast和進化發育樹的結果，初步確定E1與Flavobacteriumchungangense為同種。

2.6.2 E2菌株Blast比對結果及系統發育分析

GenBank上E2的部分相似菌株及E2系統進化發育樹見表4、圖6。

表4 GenBank上E2的部分相似菌株

由表4可見，E2與Pseudomonasasplenii的同源性最高，達100%；從圖6上可以看出，E2與Pseudomonasasplenii聚為一支，與其他菌株的差異相對較大。因此，綜合Blast和進化發育樹的結果，初步確定E2與Pseudomonasasplenii為同種。

2.6.3 E3菌株Blast比對結果及系統發育分析

GenBank上E3的部分相似菌株及E3系統進化發育樹見表5、圖7。

表5 GenBank 上E3的部分相似菌株

由表5可見，E3與Janthinobacteriumlividum的同源性最高，達99%；從圖7上可以看出，E3與Janthinobacteriumlividum聚為一支，與其他菌株的差異相對較大。因此，綜合Blast和進化發育樹的結果，初步確定E3與Janthinobacteriumlividum為同種。

3 結論與討論

本研究利用細菌的通用引物，提取各菌株的總DNA，采用PCR方法擴增得到各菌株的序列。一般認為，若同源性大于99%，則可認為它們屬同一個種；若同源性小于98%，可認為屬不同的種；同源性小于95%，可認為屬不同的屬[6]。綜合各菌株形態特征、生理生化特性及進化發育樹，參考常見細菌系統鑒定手冊和真菌鑒定手冊，初步確定E1為Flavobacteriumchungangense，E2為Pseudomonasasplenii，E3為Janthinobacteriumlividum。根據這些菌株的特征，可從篩選抗病菌株、研制抑制劑等方面對蛹蟲草栽培中的病害進行防治研究，這也為完善蛹蟲草栽培技術提供了重要依據。

[1]卯曉嵐. 我國常見食藥用菌名稱[J]. 中國食用菌，2002，21(4)：24-26.

[2]張平，朱述鈞，錢大順，等. 北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析[J]. 江蘇農業科學，2003(6)：105-107.

[3]魏群. 分子生物學試驗指導(第二版)[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[4]奧斯伯，金斯頓，塞德曼，等. 精編分子生物學實驗指南[M]. 北京：科學出版社，2001.

[5]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[6]Tejada AM, Garcia C, Gonzalez JL, et al. Use of organic amendment as a strategy for soil remediation: Influence on the physical, chemicial and biological properties of soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2006(38): 1413-1421.

Isolation and Identification of Several Kinds of Bacterial Pathogens inCordycepsmilitarisCultivation

ZHANG Yuan-yuan

(Agricultural and Science Research Institute of Ankang City, AnkangShanxi725021)

Using sequence analysis method of 16S rDNA, combining with morphological characteristics of bacterial, as well as, physiological and biochemical identification of bacteria, three bacterial, which caused disease in the cultivation ofCordycepsmilitariswere studied. The results showed that E1～E3 had high similarity withFlavobacteriumchungangense,Flavobacteriumchungangense,Janthinobacteriumlividum, respectively and speculated that it may be for their relatives. It had important guiding significance in preventing and controlling common disease on artificial cultivation ofCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris; Bacterial pathogens; Separation; Identification

*項目來源：陜西省農業廳農業科技示范項目“秦巴山區特色食用菌產業關鍵技術研究”(2011KTCL02-18)。

張園園(1987-)，女，助理農藝師，主要研究方向為秦巴山區野生珍稀食、藥用菌人工馴化栽培及富硒產品開發研究。 E-mail: zhangyuanyuan405@163.com

2014-09-22

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0046-04