蒙藥其察日嘎納對抑郁大鼠海馬S100β 蛋白表達的影響△

支小軍 韓麗莎 韓 喆 劉 佳 宋 芳 胡 海 左春發

(1.包鋼醫院，內蒙古 包頭 014040；2.包頭醫學院基礎學院，內蒙古 包頭 014040；3.包頭市第四醫院，內蒙古 包頭 014040；4.包頭醫學院2008 級臨床本科班，內蒙古 包頭 014040)

抑郁癥發病原因復雜，缺乏有效的治療是當前急待解決的問題。神經影像學發現患者腦海馬部位密度下降，神經元的樹突減少和神經元壞死。腦海馬與情緒和認知關系密切，與抑郁障礙的關系受到關注［1］。在海馬神經膠質細胞中S100β(酸性鈣結合蛋白)是腦神經膠質細胞完整性的特異標記蛋白，對神經系統損害反應極為敏感［2］。本研究應用慢性不可預知的溫和應激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立抑郁模型，觀察蒙藥其察日嘎納對抑郁大鼠抑郁程度、腦海馬S100β 蛋白表達的干預作用，揭示蒙藥對抑郁癥的作用機制，為深入研究和防治提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料: 河北康派中藥材有限公司提供內蒙產蒙藥其察日嘎納果實，批號: 103151 ，粉碎后全成分入藥，生理鹽水配制為10%濃度，4℃冰箱貯存備用。

1.2 分組及實驗方法: Wistar 成年大鼠36 只，包頭醫學院動物室提供，雌雄各半，體重150 ～255g。適應性喂養1w后根據體重隨機分為對照組、模型組、蒙藥組(抑郁模型+藥物)，每組12 只。對照組不予任何刺激，模型組、蒙藥組接受5w 的CUMS 建立抑郁模型。第6w 蒙藥組其察日嘎納每日灌胃1 次，O.1g/100g 體重;模型組及對照組灌服等量生理鹽水。

1.3 抑郁模型建立: 接受CUMS 的大鼠每日隨機給予一種刺激: 禁食(24h)、禁水(24h)、傾斜籠子(45 度斜，24h)、夾尾(1min)、束縛(8min)、電擊足底(電流1mA，每次持續5s，共15 次)，搖晃(1 次/s，5min)、噪音(5min)，共5w，相同的刺激不連續出現。

2 檢測指標

實驗11w，進行抑郁程度檢測、免疫組化染色觀察海馬S100β 蛋白的表達。

2.1 抑郁程度檢測

2.1.1 Open- Field 實驗: 安靜環境將大鼠放入80cm ×80cM 的開闊箱的中央格，開始計時。記錄大鼠5 min 內行為，每只大鼠僅做1 次開闊箱行為測定。觀察指標: 穿格次數(三爪以上跨入鄰格的次數);理毛時間(前肢向上抬舉，洗臉、抓癢，舔足時間);站立次數。

2.1.2 tail–puspension 實驗: 用粘膏條在距尾尖2 cm 處將大鼠尾粘在一側懸繩的下端，鼠頭部離地面30 cm ，記錄鼠在3 分鐘內的懸尾不動時間、扭體次數。

2.2 海馬S100β 蛋白表達

2.2.1 取材及免疫組化: 大鼠1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(1mL/kg)，腹主動脈、下腔靜脈插管，37℃0.9%的生理鹽水200 ml 快速灌注沖洗，37℃10%甲醛溶液400 mL 先快后慢進行沖洗，開顱取腦海馬，4%多聚甲醛溶液固定48 h，梯度酒精脫水，透明，包埋，冠狀切片(片厚約10μm)。常規二甲苯脫蠟乙醇水化，DAB 顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。試劑: ①鼠抗S100B 單克隆抗體 濃縮型0.1 mL，克隆號SH -B1，工作濃度為1 B100;②DAB試劑盒顯色染色和切片由武漢博士德生物工程有限公司完成。

2.2.2 結果判定: 對各組切片(每組取3 張)染色陽性細胞進行計數。每組海馬各區分別隨機選10 個視野，取平均值。每個點取3 張片，每片取連續不重復的10 個視野，平均計數陽性細胞。

2.2.3 圖像分析: 麥克奧迪圖像分析系統，觀察平均灰度、平均光密度及面密度，灰度和光密度顯示染色強度，面密度顯示陽性面積。每張切片在40 倍物鏡下測量海馬CA1 區、CA2 區、CA3 區、CA4 區和DG 區［3］，取平均值反映切片值。

3 統計處理

數據以s 表示，用統計學軟件SPSS 11. 0 進行分析，兩樣本均數比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

4 結 果

4.1 動物模型界定: CUMS 刺激5w，大鼠表現為倦怠、對外界刺激反應遲緩、活動范圍縮小、飲水和攝食減少。在給予刺激后第5w 取24h 尿，化學發光法測定測定尿皮質醇水平(nmol/24h): 模型組(38.1 ±10.9)、藥物組(37.9 ±9.2)，均明顯高于對照組(32.2 ± 9.6)(P＜0.05)，提示大鼠處于抑郁狀態，動物模型建立。

4.2 抑郁程度比較: 藥物組與模型組比較: 穿格次數和站立次數明顯增加(P ＜O.05)，其他指標無明顯統計學差異，結果見表1。

表1 Open- Field 實驗、tail -puspension 實驗(s)

4.3 海馬S100β 蛋白表達: 對照組S100β 蛋白陽性細胞胞體小，呈圓形或卵圓形，胞有突起，呈放射狀，散在分布，胞漿呈棕褐色(圖1)。模型組與對照組比較，海馬S100β陽性細胞體積增大，染色較深(圖2)，S100β 免疫反應產物陽性細胞計數值(31.74 ±4.56)較對照組(26.13 ±4.52)顯著增高(P＜0.05)。藥物組與模型組比較，S100β 陽性細胞體積縮小，染色變淺(圖3)，S100β 免疫反應產物陽性細胞計數值(27.03 ±5.41)較模型組(31.74 ±4.56)顯著減少(P＜0.05)。

大鼠海馬S100B 表達的平均灰度值比較，對照組138.8±9.1，模型組S100B 陽性信號有所增強，灰度值為119.5±13.2，兩組比較有顯著差異(P＜0.01);藥物組灰度值為120.5 ±11.2，與模型組119.5 ±13.2 比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖3 藥物組

圖1 -3 各組S100B 的表達(IHC×400)

圖1 對照組

圖2 模型組

5 討 論

腦內生理量的S100β 主要由星形膠質細胞產生，作用于神經元及w 圍生長環境，調節細胞生長、能量代謝和參與細胞內信號轉導，因此，可視為星形膠質細胞合成并分泌的一種神經營養因子，在神經元發育和損傷時維持其活力，對腦組織損傷起保護性作用［4］。正常情況下，腦內S100β 蛋白少量表達，中樞神經系統受損時水平上調，表明星形膠質細胞被激活，被認為星形膠質細胞的分子標記物之一，也被作為腦損傷的一種標記物［5］。S100β 蛋白對細胞功能的調節作用依賴于濃度水平，低濃度神經營養和保護作用，高濃度可引起神經元變性和誘導細胞凋亡［6］。

本實驗結果顯示，模型組大鼠慢性應激5w 后抑郁程度增加，海馬S100β 陽性細胞體積增大，染色變深，S100β 免疫反應產物陽性細胞計數值顯著增高，表明海馬作為情緒和行為調節的高級中樞，與應激反應、抑郁癥的發生密切相關。發生的機制可能與CUMS 使膠質細胞大量活化，干擾了神經元之間、神經元與膠質細胞間的正常聯系，致神經元變性、細胞凋亡有關［7］;而膠質細胞作為神經免疫細胞被激活，產生釋放許多細胞因子，引起機體內環境的變化，影響抑郁大鼠的行為能力。

藥物組大鼠抑郁癥狀減輕，可能與蒙藥其察日嘎納使S100β 陽性細胞體積縮小，染色變淺，S100β 免疫反應產物陽性細胞計數值顯著減少有關。而其作用的機制與其察日嘎納所含總黃酮及有效成分能直接清除氧自由基和羥自由基，降低血壓、降低血脂、降低血液粘稠度、抑制血小板聚集、軟化血管、改善腦供血供氧［8］;其察日嘎納所含的多種氨基酸，維生素、微量元素、不飽和脂肪酸(EPA、DHA)具有益智作用有關，其詳細作用機理有待深入研究。

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