藏藥濕生扁蕾對人結腸癌SW480 細胞凋亡調控因子Bcl-2及Bax 的mRNA 表達的影響△

高 娜 景 明 張艷霞 王雅莉 陳正君

(1.甘肅中醫學院定西校區，甘肅 蘭州 743000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000)

結腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道系統惡性腫瘤之一。據統計，全世界每年結腸癌的新增人數高達120 萬，死亡患者約60.87 萬［1］，嚴重威脅著人們的生活與健康。而在北美、歐洲各國，結腸癌的死亡率在癌癥死亡原因中高居第2 位［2］。隨著我國人民生活水平的改善和飲食結構的改變，結腸癌的發病率呈逐年上升趨勢［3］。目前，雖然西藥在以外科手術為主的綜合治療方面取得了一定的進展，但其5 年生存率仍維持在50%左右［4］，導致臨床治療失敗和患者死亡的主要原因是腫瘤的易復發、轉移生物學特性及其耐藥性［5，6］;其次是治療結腸癌化療藥物的較大毒副作用。因此，進一步深入探討結腸癌發病機制，探尋低毒有效的抗腫瘤藥物是當前臨床研究的熱點課題，也是腫瘤防治工作者面臨的迫切任務之一。

藏藥濕生扁蕾具有清熱解毒、健脾止瀉的功效，藏醫用全草治療腸炎、痢疾、腹瀉等疾病在臨床上取得了很好的療效［7］。近年來，隨著對濕生扁蕾有效成分研究的深入，其功效也不斷被發現。有研究表明，濕生扁蕾提取物能夠抑制動物體內S180 肉瘤及其它瘤株的生長［8］，此藥中的1 -羥基-3，7，8 -三甲氧基口 山 酮及1，7 -二羥基-3，8 -二甲氧基口 山 酮對卵巢癌細胞HO -8910 也具有毒性作用［9］。本實驗研究藏藥濕生扁蕾影響SW480 細胞凋亡的調控因子Bcl -2 及Bax 的mRNA 表達，并探討其相關機制，為結腸癌的治療和新藥開發開拓思路。

1 儀器與試藥

1.1 試驗藥物: 藏藥濕生扁蕾提取物的制備: 取濕生扁蕾藥材，粉碎，過四號篩，稱取粉末100g，加15 倍量70%乙醇回流提取1.5h，濾取藥液，藥渣再用12 倍量70%乙醇回流提取1.5h，合并兩次藥液，濾過，濾液回收乙醇后備用。藥渣揮盡乙醇，加12 倍量水煎煮1.5h，濾過，濾液減壓濃縮后與醇提浸膏合并，冷凍干燥，即得。

濕生扁蕾提取物供試液的制備: 稱取濕生扁蕾提取物50 mg，用0.02%二甲基亞砜溶解，抽濾除菌，-20℃保存備用。需要時(用生理鹽水)稀釋至工作液。

1.2 細胞株: 人結腸癌SW480 細胞株購自江蘇江陰齊氏生物科技有限公司。

1.3 試劑: DMEM 培養基(Hyclone 公司);胎牛血清(FBS，Hyclone 公司);0.25%胰蛋白酶(trypsin，Hyclone 公司);二甲亞砜(DMSO，Gibco 公司);PBS(磷酸鹽緩沖液，Hyclone公司);Trizol 試劑盒(Invitrogen 公司);RT 試劑盒和PCR試劑盒(Promega 公司);PCR 引物(上海英俊生物有限公司)。

1.4 儀器: 超凈工作臺(蘇州凈化設備公司);二氧化碳培養箱(德國Heraeus 公司);9600 型PCR 儀(美國PE 公司);Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統;5417R 高速冷凍離心機(德國Eppendorf 公司);APC 300 型電泳儀和水平式電泳槽(美國Bio-Rad 公司)。

2 方法與結果

2.1 SW480 細胞的培養: 采用常規培養SW480 細胞，培養液為含有10% 小牛血清及青、鏈霉素各100u/ml DMEM液，在37℃，飽和濕度，5%CO2 孵箱中培養，細胞單層貼壁生長至80% ～90%融合時，以0.25%胰蛋白酶/EDTA 消化后傳代培養，處于對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 RT-PCR 法檢測Bc1 -2 和Bax 的mRNA 表達: 對數生長期的SW480 細胞經胰酶消化后，接種于6 孔培養板中，細胞數量約為2 ×105 個/孔，24 h 后分別以不同濃度(250、500、1000 μg/ml)的濕生扁蕾提取物干預，繼續培養24h 后，提取每組總RNA。

2.2.1 細胞總RNA 的提取: 按照Trizol 試劑盒說明方法進行，隨后取2μgRNA 按照逆轉錄反應試劑盒要求配制反應體系進行反轉錄，反轉錄后產物置于-20℃保存，用于PCR 擴增。

2.2.2 目的基因PCR 擴增: 在NCBI 上查目的基因全序列，利用Premier5.0 軟件設計引物序列。Bcl -2: F: 5' -CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT - 3'，R: 5' - GCC TCC GTT ATC CTG GAT CC-3';Bax: F: 5' -TGC TTC AGG GTT TCA TCC AGG-3'，R: 5' -TGG CAA AGT AGA AAA GGG CGA-3';GAPDH: F: 5' - CG ACC ACT TTG TCA AGC TCA-3'，R: 5' - AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG-3';β-actin: F: 5`-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCCTA-3`，R: 5`-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3`。取cDNA 1.0?l，加10 × Taq Buffer2. 0?l，25 mM Mg2 + 1. 2?l，10 mM dNTP0.4?l，上下游引物各0.4?l，1U/mlTaq 酶0.6?l，DEPC 水14.0?l 配成20?l 的總反應體積。在95℃預變性3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35 個循環，72℃10min。擴增產物4℃保存，用于瓊脂糖凝膠電泳。

2.2.3 PCR 產物表達: 取PCR 擴增產物10μl，加2μl 的loading buffer(6 ×)充分混勻后加到1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，通電，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿后停止電泳。

結果表明，SW480 細胞經不同濃度濕生扁蕾處理24 h后，Bcl-2 mRNA 的表達隨濃度增加而減少，而Bax mRNA表達隨濃度增加而增多，并呈現明顯的劑量依賴關系。濕生扁蕾對SW480 細胞Bcl -2 mRNA 及BaxmRNA 表達的電泳圖見圖1、圖2。

圖1 濕生扁蕾對SW480 細胞Bcl-2mRNA及BaxmRNA 表達的電泳圖(內參GAPDH)

圖2 濕生扁蕾對SW480 細胞Bcl-2 mRNA及BaxmRNA 表達的電泳圖(內參β-actin)

3 討 論

細胞凋亡是由體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程，適度適時的細胞凋亡是維持細胞群體數量穩態的重要手段，而如果凋亡失調就會影像機體的正常生長、發育，并可導致各種疾病［10］。腫瘤是機體在各種滯留因素的作用下，細胞生長調控發生嚴重紊亂、細胞異常增殖而形成的新生物，常表現為局部的異常組織團塊［11］。

目前認為，腫瘤的發生與細胞凋亡不足密切相關。Bcl-2 家族的成員是高等動物中生存和死亡信號重要的整合因子。該家族成員分為三大類，抗凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-XL 等;促凋亡基因，如Bax、Bak 等;雙向調控基因，如c-myc，Bclx［12］。其中Bcl-2 和Bax 表達的比例是決定細胞凋亡與否的關鍵。Bcl -2 本身的活性受相關蛋白Bax的調節，Bax 增高時能和Bcl -2 形成異二聚體(Bcl -2 -Bax)，抑制Bcl-2 的功能從而抑制細胞凋亡，反之則形成二聚體(Bax-Bax)誘導凋亡［13，14］。因此，Bax/Bcl-2 的比例決定了細胞對凋亡刺激的敏感性，最終決定了細胞的生存和死亡。

本實驗結果表明，藏藥濕生扁蕾作用結腸癌SW480 細胞24 h 后，Bcl -2 mRNA 的表達減少，而Bax mRNA 表達增多，并呈現明顯的劑量依賴關系。說明濕生扁蕾引起凋亡基因Bcl-2、Bax 表達的變化可能是其促進SW480 細胞凋亡的機制之一，而通過濕生扁蕾對SW480 細胞Bcl -2、Bax 表達的的調節可能有助于改善結腸癌患者的病情及生存狀況。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et a1.Global Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2) ：69 -90.

［2］Sanoff HK，Sargent DJ，Campbell ME，et al. Five -year data and prognostic factor analysis of oxaliplatin and irinotecan combinations for advanced colorectal cancer： N9741［J］.J Clin Oncol，2008，26(35) ： 5721 -5727.

［3］李寶國.結腸癌診治的回顧與展望［J］. 齊齊哈爾醫學院學報，2010，31(13) ：2124 -2125.

［4］Ransohoff DF. How much does colonoscopy reduce colon cancer mortality［J］. Ann Intern Med，2009，150(1) ：50-52.

［5］Efremidou EI，Liratzopoulos N，Papageorgiou SM，et a1.Colorectal carcinoma：correlation between age，gender and subsite distribution［J］. Chirurgia( Bucur) ，2008，103(6) ：659 -663.

［6］Kingham TP，Pachter HL. Colonic anastomotic leak： risk factors，diagnosis，and Treatment［J］. J Am Coll Surg，2009，208(6) ：1152 -1153.

［7］王煥弟，譚成玉，白雪芳，等.藏藥濕生扁蕾的抑菌作用研究［J］.時珍國醫藥，2006，17(10) ：190.

［8］張寶琛，甄潤德，胡柏林等. 濕生扁蕾化學成分的研究［J］.中草藥，1980，11：149 -151.

［9］米琴，曹長年，趙宙興，等. 藏藥濕生扁蕾有效成份的研究［J］.青海師范大學學報( 自然科學版) ，2005，2：64 -66.

［10］ang JZ，Chen GQ. Textbook of Pathophysiology ( M)2006； 12：154 -165.

［11］李玉林.病理學［M］. 第7 版.北京：人民衛生出版社，2008. 5：76 -77.

［12］Ola MS，Nawaz M，Ahsan H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis［J］. Mol Cell Biochem，2011，351(1 -2) ：41 -58.

［13］樊蔚虹，姚建平，趙文景. 柴胡疏肝散對卒中后抑郁大鼠海馬組織Bcl-2，Bax 蛋白表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(3) ：181 -183.

［14］張力，龔明玉，李毅學，等. 放療聯合熱療誘導HepG2 細胞凋亡及其與Bcl -2 和Bax 蛋白表達關系的研究［J］. 中國全科醫學，2011，14( 2C) ： 627 -630.