局部注射BDNF對壓力性尿失禁模型大鼠LPP及EUS內BDNF的影響

馬翠+王志蓮+郝敏

【摘要】 目的：探究陰部神經（PN）損傷后局部注入腦源性神經營養因子（BDNF）對壓力性尿失禁模型大鼠漏尿點壓力（LPP）及尿道外括約肌（EUS）腦源性神經營養因子表達的影響。方法：SD大鼠接受模擬分娩損傷和雙側卵巢切除，并建立壓力性尿失禁模型。2周后評估模型建立是否成功。造模成功后，大鼠按照隨機數字表法分為三組：BDNF組，損傷PN后局部注入BDNF，縫合后標記部位，第4、6、8天分別于標記部位再次注射；生理鹽水組，損傷PN后局部注入生理鹽水，量及方法同上；假損傷組，分離PN未損傷。2周后再次進行漏尿點壓力及噴嚏實驗。隨后處死大鼠，取EUS行免疫組化，觀察BDNF表達變化。結果：PN損傷后，統計學分析顯示，生理鹽水組LPP明顯低于BDNF組和假損傷組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而BDNF組與假損傷組比較差異無統計學意義（P>0.05）；HE染色顯示，生理鹽水組與假損傷組相比，肌纖維斷裂及橫紋肌排列致密程度均明顯下降；免疫組化結果顯示，假損傷組括約肌內BDNF含量低，與BDNF組及生理鹽水組比較差異均有統計學意義（P<0.05），BDNF組與生理鹽水組括約肌內BDNF含量比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論：局部注射腦源性神經營養因子可能通過刺激神經再生從而促進尿道外括約肌的恢復，進而有利于壓力性尿失禁大鼠LPP的恢復。

【關鍵詞】 壓力性尿失禁； 腦源性神經營養因子； 陰部神經； 尿道外括約肌

流行病學調查顯示，我國尿失禁的總患病率為30.9%，其中壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）患病率為18.9%，占總患病率的61%[1]，并且隨著人口老齡化，發病人數有所增加。目前SUI發病類型逐漸趨向混合、復雜化，并成為全球關注的新高發疾病[2]。

SUI發生時盆底神經發生退行性變化，SUI的女性可見陰部神經對尿道橫紋肌和盆底肌肉的傳導延遲及對尿道外括約肌失神經支配。大量的動物實驗證實，陰部神經損傷與SUI的癥狀有直接的因果關系[3]。目前SUI的治療方法有多種，但是從根本上改善神經肌肉的病理生理的治療方式卻并不多見。神經科學研究已經表明，神經營養因子是調節神經生長和存活的一類蛋白質。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是目前研究較多的一種神經營養因子，它對神經元有促進修復再生及支持、營養、保護的作用。研究發現，BDNF可以提高神經元軸突切斷術后的存活。本研究旨在探討陰部神經損傷后局部注入BDNF對壓力性尿失禁模型大鼠漏尿點壓力的影響及尿道外括約肌內BDNF表達的影響，為SUI的非手術治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康雌性SD大鼠40只，鼠齡6周，體重240～280 g。造模成功大鼠為36只，按照隨機數字表法分為三組：BDNF組、生理鹽水組、假損傷組各12只。三組大鼠一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器 重組人腦源性神經營養因子（ProSpec-Tany）、兔抗鼠BDNF抗體（博奧森公司）、SABC（兔IgG）試劑盒（博士德公司）；BL-420生物機能實驗系統、BI-2000醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立與處理 卵巢切除+陰道擴張建立大鼠SUI模型[4-5]。造模2周后進行尿動力學檢查及噴嚏實驗。測定結束后，造模成功后大鼠按照隨機數字表法分為三組，分離PN，用持針器夾住PN兩次，每次持續30 s。BDNF組隨后用10 μL微量加樣器注入2 μL BDNF于神經損傷部位，絲線縫合[6]，隨后第4、6、8天分別于標記部位再次進行注射。生理鹽水組也同樣損傷PN后局部注入生理鹽水，量及方法同上。假損傷組分離PN未損傷。注射2周后進行尿動力學檢查[7]。

1.3.2 標本采集 處死大鼠，取出尿道括約肌組織，用無菌生理鹽水沖洗后用4%多聚甲醛緩沖溶液固定24 h，行HE染色和免疫組化染色。

1.3.3 圖像分析 顯微鏡觀察免疫反應陽性的細胞在肌肉中的分布，BDNF蛋白免疫反應陽性物質呈棕黃色。應用BI-2000醫學圖像分析系統分析BDNF陽性反應灰度。陽性反應強度用積分光密度值表示。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，LPP數據及積分光密度數值用（x±s）表示，采用單因素方差分析，LSD-t法進行組間比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

陰部神經損傷后2只大鼠在實驗中死亡，BDNF組及生理鹽水組各1只，最后進入統計數據的為34只。

2.1 三組HE染色結果的比較 生理鹽水組（圖C）與假損傷組（圖A）相比，尿道全層變薄，結構不明顯，肌層萎縮，肌纖維斷裂及橫紋肌致密程度明顯下降。BDNF組（圖B）與假損傷組（圖A）相比，肌纖維疏松程度差異不顯著。

2.2 三組尿動力學檢查結果和免疫組化結果的比較 PN損傷后，統計學分析顯示，生理鹽水組LPP明顯低于BDNF組和假損傷組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而BDNF組與假損傷組比較差異無統計學意義（P>0.05）。免疫組織化學染色陽性區域顯色為棕黃色至棕褐色。通過圖像分析系統得到積分光密度值，積分光密度數值與BDNF含量成正比。免疫組化結果顯示，假損傷組括約肌內BDNF含量低，與BDNF組及生理鹽水組比較差異均有統計學意義（P<0.05），BDNF組與生理鹽水組括約肌內BDNF含量比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

壓力性尿失禁有“社交癌”之稱，嚴重影響女性的社交活動并能引起心理障礙，給家庭和國家醫療服務增加了沉重的經濟負擔[8]。盆底神經退行性變化或失神經支配的肌纖維逐漸纖維化的神經損傷學機制與SUI的發病密切相關。引起盆底功能障礙的原因有妊娠、陰道分娩等。有學者研究發現，80%經陰道分娩的女性存在陰部神經損傷和盆底肌去神經支配現象。妊娠、陰道分娩使盆底肌過度擴張，牽拉神經纖維引起嚴重損傷，這會使其支配的肌肉發生去神經改變，如肌肉萎縮、角型化，無去神經支配的肌肉則代償性肥大。如果肌肉獲得再神經支配，則肌纖維恢復正常大小，但是同型纖維聚集變得明顯，而無再神經支配的纖維逐漸被纖維化取代。治療壓力性尿失禁的方法除手術方法外，目前正在探索非手術治療方法。尿道高活動性或盆腔器官脫垂是可以通過手術進行治療的引起壓力性尿失禁的機械性病因，但手術治療多以改善臨床癥狀為目的[9]。對于括約肌損傷，目前認為最佳的治療方式為注射填充劑、物理治療、再生療法，例如干細胞治療。但是在陰部神經損傷存在的情況下，針對神經再生的治療可能是更為有利的治療方法[10-11]。endprint

LPP統計學分析顯示，生理鹽水組LPP低于BDNF組和假損傷組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示BDNF在神經損傷修復方面有作用。BDNF組漏尿點壓力低于假損傷組，可能與BDNF劑量或注入時間及神經恢復時間有關，但是差異無統計學意義（P>0.05）。實驗中發現損傷陰部神經后大鼠漏尿點壓力比大鼠造模成功后漏尿點壓力有所下降，提示陰部神經損傷與大鼠壓力性尿失禁有關。

BDNF是神經營養因子家族重要成員之一，具有促進神經細胞生長、分化和損傷細胞修復的作用，并且能夠有效地阻止多種神經元的死亡。BDNF可防止損傷神經元乙酰膽堿轉移酶減少和促進神經細胞軸突的再生，同時增加靶細胞及神經元細胞本身合成BDNF及增強BDNF逆軸索運輸到胞體發揮營養作用，這有利于重建突觸聯系及促進運動神經元存活。外源性BDNF可改善運動神經纖維傳導速度及腹側神經根軸突髓磷脂變性，從而保護運動神經元。

本研究顯示，生理鹽水組與假損傷組相比，尿道全層變薄，肌纖維排列較為稀疏，肌層萎縮，肌纖維斷裂及橫紋肌致密程度有所下降。BDNF組與假損傷組相比，肌纖維疏松程度差異不顯著，推測BDNF對損傷PN的修復有作用。假損傷組BDNF表達含量低于BDNF組及生理鹽水組，差異均有統計學意義（P<0.05），證實大鼠周圍神經損傷后神經支配靶器官內源性BDNF表達上調[12]。這提示妊娠、分娩等因素造成的盆底神經失支配在一段時間后會有某種程度的恢復或許與盆底神經靶器官BDNF表達增加有關。

免疫組化顯示，假損傷組BDNF含量最低，與BDNF組及生理鹽水組比較差異均有統計學意義（P<0.05），這提示局部神經損傷后靶器官內BDNF含量增加。BDNF組與生理鹽水組比較，BDNF組內BDNF含量少于生理鹽水組，但是差異無統計學意義（P>0.05），可能與BDNF促進神經再生有關。根據研究，BDNF應該可以應用于壓力性尿失禁發生時的盆底神經損傷，尤其是壓力性尿失禁發生初期，如果及時進行損傷神經的修復，肌纖維失神經支配后的一系列變化就可能不會發生。因此，BDNF的治療可能可以改善PN損傷后神經肌肉節制機制的功能恢復。

實驗表明，局部補充神經營養因子對于促進神經再生是有效的，這為壓力性尿失禁的治療提供參考依據。但是局部注射BDNF有一定的局限性，例如注射部位及劑量均不易掌握，因此可以利用微型滲透泵來為神經損傷部位提供勻速、均量的持續營養，這有待于進一步研究。

參考文獻

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[11] Carr L K，Steele D，Steele S，et al.1-year follow-up of autologous muscle-derived stem cell injection pilot study to treat stress urinary incontinence[J].International Urogynecology Journal，2008，19（6）：881-883.

[12] Omura T，Sano M，Omura K，et al.Different expressions of BDNF，NT3，and NT4 in muscle and nerve after various types of peripheral nerve injuries[J].Journal of the Peripheral Nervous System，2005，10（3）：293-300.

（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：歐麗）endprint

LPP統計學分析顯示，生理鹽水組LPP低于BDNF組和假損傷組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示BDNF在神經損傷修復方面有作用。BDNF組漏尿點壓力低于假損傷組，可能與BDNF劑量或注入時間及神經恢復時間有關，但是差異無統計學意義（P>0.05）。實驗中發現損傷陰部神經后大鼠漏尿點壓力比大鼠造模成功后漏尿點壓力有所下降，提示陰部神經損傷與大鼠壓力性尿失禁有關。

BDNF是神經營養因子家族重要成員之一，具有促進神經細胞生長、分化和損傷細胞修復的作用，并且能夠有效地阻止多種神經元的死亡。BDNF可防止損傷神經元乙酰膽堿轉移酶減少和促進神經細胞軸突的再生，同時增加靶細胞及神經元細胞本身合成BDNF及增強BDNF逆軸索運輸到胞體發揮營養作用，這有利于重建突觸聯系及促進運動神經元存活。外源性BDNF可改善運動神經纖維傳導速度及腹側神經根軸突髓磷脂變性，從而保護運動神經元。

本研究顯示，生理鹽水組與假損傷組相比，尿道全層變薄，肌纖維排列較為稀疏，肌層萎縮，肌纖維斷裂及橫紋肌致密程度有所下降。BDNF組與假損傷組相比，肌纖維疏松程度差異不顯著，推測BDNF對損傷PN的修復有作用。假損傷組BDNF表達含量低于BDNF組及生理鹽水組，差異均有統計學意義（P<0.05），證實大鼠周圍神經損傷后神經支配靶器官內源性BDNF表達上調[12]。這提示妊娠、分娩等因素造成的盆底神經失支配在一段時間后會有某種程度的恢復或許與盆底神經靶器官BDNF表達增加有關。

免疫組化顯示，假損傷組BDNF含量最低，與BDNF組及生理鹽水組比較差異均有統計學意義（P<0.05），這提示局部神經損傷后靶器官內BDNF含量增加。BDNF組與生理鹽水組比較，BDNF組內BDNF含量少于生理鹽水組，但是差異無統計學意義（P>0.05），可能與BDNF促進神經再生有關。根據研究，BDNF應該可以應用于壓力性尿失禁發生時的盆底神經損傷，尤其是壓力性尿失禁發生初期，如果及時進行損傷神經的修復，肌纖維失神經支配后的一系列變化就可能不會發生。因此，BDNF的治療可能可以改善PN損傷后神經肌肉節制機制的功能恢復。

實驗表明，局部補充神經營養因子對于促進神經再生是有效的，這為壓力性尿失禁的治療提供參考依據。但是局部注射BDNF有一定的局限性，例如注射部位及劑量均不易掌握，因此可以利用微型滲透泵來為神經損傷部位提供勻速、均量的持續營養，這有待于進一步研究。

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[12] Omura T，Sano M，Omura K，et al.Different expressions of BDNF，NT3，and NT4 in muscle and nerve after various types of peripheral nerve injuries[J].Journal of the Peripheral Nervous System，2005，10（3）：293-300.

（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：歐麗）endprint

LPP統計學分析顯示，生理鹽水組LPP低于BDNF組和假損傷組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示BDNF在神經損傷修復方面有作用。BDNF組漏尿點壓力低于假損傷組，可能與BDNF劑量或注入時間及神經恢復時間有關，但是差異無統計學意義（P>0.05）。實驗中發現損傷陰部神經后大鼠漏尿點壓力比大鼠造模成功后漏尿點壓力有所下降，提示陰部神經損傷與大鼠壓力性尿失禁有關。

BDNF是神經營養因子家族重要成員之一，具有促進神經細胞生長、分化和損傷細胞修復的作用，并且能夠有效地阻止多種神經元的死亡。BDNF可防止損傷神經元乙酰膽堿轉移酶減少和促進神經細胞軸突的再生，同時增加靶細胞及神經元細胞本身合成BDNF及增強BDNF逆軸索運輸到胞體發揮營養作用，這有利于重建突觸聯系及促進運動神經元存活。外源性BDNF可改善運動神經纖維傳導速度及腹側神經根軸突髓磷脂變性，從而保護運動神經元。

本研究顯示，生理鹽水組與假損傷組相比，尿道全層變薄，肌纖維排列較為稀疏，肌層萎縮，肌纖維斷裂及橫紋肌致密程度有所下降。BDNF組與假損傷組相比，肌纖維疏松程度差異不顯著，推測BDNF對損傷PN的修復有作用。假損傷組BDNF表達含量低于BDNF組及生理鹽水組，差異均有統計學意義（P<0.05），證實大鼠周圍神經損傷后神經支配靶器官內源性BDNF表達上調[12]。這提示妊娠、分娩等因素造成的盆底神經失支配在一段時間后會有某種程度的恢復或許與盆底神經靶器官BDNF表達增加有關。

免疫組化顯示，假損傷組BDNF含量最低，與BDNF組及生理鹽水組比較差異均有統計學意義（P<0.05），這提示局部神經損傷后靶器官內BDNF含量增加。BDNF組與生理鹽水組比較，BDNF組內BDNF含量少于生理鹽水組，但是差異無統計學意義（P>0.05），可能與BDNF促進神經再生有關。根據研究，BDNF應該可以應用于壓力性尿失禁發生時的盆底神經損傷，尤其是壓力性尿失禁發生初期，如果及時進行損傷神經的修復，肌纖維失神經支配后的一系列變化就可能不會發生。因此，BDNF的治療可能可以改善PN損傷后神經肌肉節制機制的功能恢復。

實驗表明，局部補充神經營養因子對于促進神經再生是有效的，這為壓力性尿失禁的治療提供參考依據。但是局部注射BDNF有一定的局限性，例如注射部位及劑量均不易掌握，因此可以利用微型滲透泵來為神經損傷部位提供勻速、均量的持續營養，這有待于進一步研究。

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[7] Stach-Lempinen B，Hakala A L，Laippala P，et al.Severe depression determines quality of life in urinary incontinent women[J].Neurourol Urodyn，2003，22（6）：563-568.

[8]朱蘭，郎景和，劉春燕，等.我國成年女性尿失禁患病狀況的流行病學研究[J].中華婦產科雜志，2009，44（10）：776-779.

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[11] Carr L K，Steele D，Steele S，et al.1-year follow-up of autologous muscle-derived stem cell injection pilot study to treat stress urinary incontinence[J].International Urogynecology Journal，2008，19（6）：881-883.

[12] Omura T，Sano M，Omura K，et al.Different expressions of BDNF，NT3，and NT4 in muscle and nerve after various types of peripheral nerve injuries[J].Journal of the Peripheral Nervous System，2005，10（3）：293-300.

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