針刺對慢性腦缺血腦皮質區自由基相關指標影響及其機制

張文麗+詹宇豪+沈俊明等

【摘要】 目的：明確針刺對慢性腦缺血的腦皮質區自由基相關指標影響及其機制。方法：將實驗大鼠隨機分為正常、慢性腦缺血（IR）和針刺組，對比觀察各組動物慢性腦缺血5周時腦皮質病理變化及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）含量的影響。結果：IR組SOD 值較正常組顯著降低，針刺組的SOD活性表達明顯高于IR組，ROS、XOD活性低于IR組，而MDA的活性明顯低于IR組（P<0.05或P<0.01）。結論：針刺對慢性腦缺血有一定保護作用，此作用機制可能是針刺通過清除自由基，降低脂質過氧化應激而保護慢性腦缺血的神經功能損傷。

【關鍵詞】 針刺； 自由基； 慢性腦缺血

慢性腦缺血表現為頭痛、頭暈、失眠、記憶力減退、健忘等癥狀，是臨床常見病、多發病之一；近年來呈逐年上升并有年輕化的趨勢，嚴重影響人們的生活質量。在人類對抗腦血管疾病的歷史進程中，針刺發揮了非常重要作用，為中華民族的醫療衛生做出了不可磨滅的貢獻，是中國腦血管病防治的特色所在[1-3]。現代實驗研究發現針刺能不同程度提高腦耐缺血缺氧能力，而且對慢性腦缺血多偏重于臨床治療觀察[4-5]，本文從基礎研究入手旨在探討針刺對慢性腦缺血腦皮質區自由基相關指標影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只Wistar 健康雄性大鼠體重250～320 g；購于北京維通利華公司。SOD、ROS、MDA、XOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組 動物隨機分成正常組、慢性腦缺血組（IR）、針刺組，每組10只；針刺組于第一次腦缺血后2 h內立即針刺，以后每日一次針刺大椎、百會穴30 min。各組均常規飼養。

1.3 模型制備 通過兩血管法即雙側頸總動脈結扎建立腦缺血模型，模型大鼠在1周內分2次結扎雙側頸總動脈（分別在第1天和第7天）。術前禁食12 h、禁水4 h。仰臥位，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，頸部消毒后正中切開，鈍性分離出一側迷走神經與頸總動脈，用4號絲線雙重結扎一側頸總動脈，縫合時切口內注慶大霉素注射液4萬單位預防感染。該側結扎后間隔7 d行第二次手術，同法結扎該側頸總動脈。大鼠術后放保溫毯上使其肛溫保持在36.5～37.0 ℃至蘇醒。制作模型過程中未有死亡動物。

1.4 針刺方法 針刺參照《實驗針灸學》中大鼠的常用針灸穴位定位方法，自制針刺鼠裝置；選取“百會、大椎”。“百會”穴在頂骨正中，“大椎”穴在背部正中第7頸椎與第1胸椎間。刺法：以30號1寸毫針（天協牌，蘇州天協針灸器械有限公司生產）向前斜刺入“百會”5 mm，直刺入“大椎”5 mm。捻轉1 min后，留針30 min，每隔5分鐘捻針一次。每天1次，均在上午10點左右進行，連續治療5周。針刺組大鼠于末次進針后4 h內用10%水合氯醛腹腔麻醉后迅速斷頭取腦。

1.5 腦皮質病理變化 取額葉皮質多聚甲醛內固定，然后進行HE染色觀察病理變化。

1.6 腦皮質自由基相關指標的測定 取解凍后腦皮質，用天平稱重，按照1：9 w/v加入生理鹽水，組織在水浴中勻漿，低溫離心機中離心10 min取上清液（2000 r/min），采用黃嘌呤氧化酶法測定腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力；硫代巴比妥酸法測定腦丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。活性氧（reactive oxygen species，ROS）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力含量測定采用比色法。具體操作按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒內操作指南進行。

1.7 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腦皮質區病理學改變 正常組額葉皮層細胞結構排列整齊，皮層神經元及膠質細胞正常。IR組時額葉皮層細胞固縮、壞死，小血管水腫明顯、有的管腔出現閉塞；神經元變性壞死，數量明顯減少，排列稀疏，錐體細胞層變薄，核變淺，基質疏松及空泡形成。針刺組額葉皮層，神經元細胞結構基本正常，出現少量錐體細胞脫失，部分錐體細胞缺血明顯改善，可見膠質細胞和小血管增生。

2.2 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD的變化 如表1所示，與正常組比較，慢性腦缺血組SOD 值顯著降低（P<0.05）， 而ROS、XOD、MDA均顯著升高（P<0.01）。與IR 組比較，針刺組SOD 顯著升高（P<0.05），ROS、XOD、MDA均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

慢性腦缺血是通過各種原因引起長期的腦灌注不足，腦發生組織病理改變，國內外大量研究發現大多數腦梗死和老年癡呆癥的發病前期都曾有長期慢性腦缺血的存在[6]。本實驗通過1周內分2次手術進行永久性結扎大鼠雙側頸總動脈，制備慢性腦缺血的動物模型，這種方法實質上是以慢性低灌注引起腦缺血缺氧，最終導致神經細胞的功能下降、學習記憶功能障礙。此模型能較好地模擬人類因動脈管腔狹窄、動脈粥樣硬化等因素導致的血管性腦卒中。有人認為大鼠雙側頸總動脈結扎后2.5 h腦血流量減少25%～90%，1周后仍下降并持續數月。且結扎1周皮層葡萄糖利用下降20%～30%，海馬葡萄糖利用下降15%。雙側頸總動脈術后3周即為慢性缺血期[7]。氧化應激損傷被認為是引起慢性腦缺血后神經細胞損傷的重要因素之一。神經細胞對氧自由基極為敏感，產生一系列自由基連鎖反應，攻擊灰質的神經元等富含脂質的腦組織，造成嚴重的氧化應激狀態，誘導細胞調亡，并使初始缺血損傷不嚴重的神經元也發生壞死[8]。endprint

根據傳統理論，針刺可以疏通經絡，調和氣血，治療疾病。其治療機理也越來越成為研究的熱點。Tanaka等[9]發現雙側頸總動脈結扎術后1 d至6周，SOD活性較對照組下降明顯；其他實驗也發現電針能降低大鼠腦組織內MDA含量， 增強SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結果相一致。在慢性腦缺血過程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發生脂質過氧化反應，從而導致神經元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，其含量的變化間接的反應了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，是機體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應最重要的防御酶，保護細胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類，是體內核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過程中其對自由基的產生起了重要作用。ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死。本研究結果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關。本實驗研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經細胞、錐體細胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理損傷，其一系列變化與氧化應激密切相關。因此針刺可以挽救瀕死的神經元、啟動應激機制、防止腦細胞脂質過氧化、減輕自由基對機體的損傷。但較多環節較多靶點的參與機制還需進一步深入研究。

參考文獻

[1] 李寶棟，志勇，白晶，等.頭穴叢刺對大鼠缺血腦組織血管內皮生長因子表達的影響[J].世界針灸雜志，2008，18（1）：38-44.

[2]楊秋匯.頭針治療急性期缺血性中風194例血液流變學觀察[J].山西中醫，2007，23（4）：54.

[3]孫文華，馬雄英.水針針刺并用對腦血栓患者血液流變學的影響[J].中外醫療，2010，29（1） ：118.

[4]唐曦，劉小衛，殷堅，等.全經針刺法對恢復期腦梗死腦血流動力學影響的臨床研究[J].中國醫藥導報，2011，8（17） ：102-105.

[5] Schalow G，Jaigma P.Cerebral palsy improvement achieved by coordination dynamics therapy[J].Electrom yogr Clin Neurophysiol，2005，45（7-8）：433-445.

[6]正公樸， 陳醒言， 朱桐君. 慢性腦缺血與癡呆[J].中國臨床康復， 2005，9（5）：129-131.

[7] Tanaka K， Wada N， Ogawa N. Chronic cerebral hypoperfusion induces transient reversible monoaminergic changes in the rat brain[J].Neurochem Res，2000，25（2）：313-320.

[8]張瑞，付秀英.熱處理在腦缺血再灌注損傷中的作用及其機制[J].中國醫學創新，2013，10（33）：6-7.

[9] Tanaka K， Wada N， Miyazaki I， et a1. Chronic cerebral hypoperfusion induces stiatal alterations due to the transient increase of NO production and the depression of glutathnione content [J]. Neurochem Res，2002，27（13）：331-336.

[10] 張天生，楊露，胡榮，等.不同時程電針對大鼠大腦中動脈阻塞再灌注區腦組織興奮性氨基酸含量的影響[J].針刺研究，2007，32（4）：234-236.

[11] Gan Y，Huang G，Zhang M.Effect of acupuncture on neuronal apoptosis after focal cerebral ischemic reperfusion Injury in Rats[J].World Journal of Acupuncture-Moxibustion，2007，17（3）：13-16.

（收稿日期：2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）endprint

根據傳統理論，針刺可以疏通經絡，調和氣血，治療疾病。其治療機理也越來越成為研究的熱點。Tanaka等[9]發現雙側頸總動脈結扎術后1 d至6周，SOD活性較對照組下降明顯；其他實驗也發現電針能降低大鼠腦組織內MDA含量， 增強SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結果相一致。在慢性腦缺血過程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發生脂質過氧化反應，從而導致神經元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，其含量的變化間接的反應了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，是機體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應最重要的防御酶，保護細胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類，是體內核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過程中其對自由基的產生起了重要作用。ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死。本研究結果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關。本實驗研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經細胞、錐體細胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理損傷，其一系列變化與氧化應激密切相關。因此針刺可以挽救瀕死的神經元、啟動應激機制、防止腦細胞脂質過氧化、減輕自由基對機體的損傷。但較多環節較多靶點的參與機制還需進一步深入研究。

參考文獻

[1] 李寶棟，志勇，白晶，等.頭穴叢刺對大鼠缺血腦組織血管內皮生長因子表達的影響[J].世界針灸雜志，2008，18（1）：38-44.

[2]楊秋匯.頭針治療急性期缺血性中風194例血液流變學觀察[J].山西中醫，2007，23（4）：54.

[3]孫文華，馬雄英.水針針刺并用對腦血栓患者血液流變學的影響[J].中外醫療，2010，29（1） ：118.

[4]唐曦，劉小衛，殷堅，等.全經針刺法對恢復期腦梗死腦血流動力學影響的臨床研究[J].中國醫藥導報，2011，8（17） ：102-105.

[5] Schalow G，Jaigma P.Cerebral palsy improvement achieved by coordination dynamics therapy[J].Electrom yogr Clin Neurophysiol，2005，45（7-8）：433-445.

[6]正公樸， 陳醒言， 朱桐君. 慢性腦缺血與癡呆[J].中國臨床康復， 2005，9（5）：129-131.

[7] Tanaka K， Wada N， Ogawa N. Chronic cerebral hypoperfusion induces transient reversible monoaminergic changes in the rat brain[J].Neurochem Res，2000，25（2）：313-320.

[8]張瑞，付秀英.熱處理在腦缺血再灌注損傷中的作用及其機制[J].中國醫學創新，2013，10（33）：6-7.

[9] Tanaka K， Wada N， Miyazaki I， et a1. Chronic cerebral hypoperfusion induces stiatal alterations due to the transient increase of NO production and the depression of glutathnione content [J]. Neurochem Res，2002，27（13）：331-336.

[10] 張天生，楊露，胡榮，等.不同時程電針對大鼠大腦中動脈阻塞再灌注區腦組織興奮性氨基酸含量的影響[J].針刺研究，2007，32（4）：234-236.

[11] Gan Y，Huang G，Zhang M.Effect of acupuncture on neuronal apoptosis after focal cerebral ischemic reperfusion Injury in Rats[J].World Journal of Acupuncture-Moxibustion，2007，17（3）：13-16.

（收稿日期：2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）endprint

根據傳統理論，針刺可以疏通經絡，調和氣血，治療疾病。其治療機理也越來越成為研究的熱點。Tanaka等[9]發現雙側頸總動脈結扎術后1 d至6周，SOD活性較對照組下降明顯；其他實驗也發現電針能降低大鼠腦組織內MDA含量， 增強SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結果相一致。在慢性腦缺血過程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發生脂質過氧化反應，從而導致神經元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，其含量的變化間接的反應了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，是機體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應最重要的防御酶，保護細胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類，是體內核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過程中其對自由基的產生起了重要作用。ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死。本研究結果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關。本實驗研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經細胞、錐體細胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理損傷，其一系列變化與氧化應激密切相關。因此針刺可以挽救瀕死的神經元、啟動應激機制、防止腦細胞脂質過氧化、減輕自由基對機體的損傷。但較多環節較多靶點的參與機制還需進一步深入研究。

參考文獻

[1] 李寶棟，志勇，白晶，等.頭穴叢刺對大鼠缺血腦組織血管內皮生長因子表達的影響[J].世界針灸雜志，2008，18（1）：38-44.

[2]楊秋匯.頭針治療急性期缺血性中風194例血液流變學觀察[J].山西中醫，2007，23（4）：54.

[3]孫文華，馬雄英.水針針刺并用對腦血栓患者血液流變學的影響[J].中外醫療，2010，29（1） ：118.

[4]唐曦，劉小衛，殷堅，等.全經針刺法對恢復期腦梗死腦血流動力學影響的臨床研究[J].中國醫藥導報，2011，8（17） ：102-105.

[5] Schalow G，Jaigma P.Cerebral palsy improvement achieved by coordination dynamics therapy[J].Electrom yogr Clin Neurophysiol，2005，45（7-8）：433-445.

[6]正公樸， 陳醒言， 朱桐君. 慢性腦缺血與癡呆[J].中國臨床康復， 2005，9（5）：129-131.

[7] Tanaka K， Wada N， Ogawa N. Chronic cerebral hypoperfusion induces transient reversible monoaminergic changes in the rat brain[J].Neurochem Res，2000，25（2）：313-320.

[8]張瑞，付秀英.熱處理在腦缺血再灌注損傷中的作用及其機制[J].中國醫學創新，2013，10（33）：6-7.

[9] Tanaka K， Wada N， Miyazaki I， et a1. Chronic cerebral hypoperfusion induces stiatal alterations due to the transient increase of NO production and the depression of glutathnione content [J]. Neurochem Res，2002，27（13）：331-336.

[10] 張天生，楊露，胡榮，等.不同時程電針對大鼠大腦中動脈阻塞再灌注區腦組織興奮性氨基酸含量的影響[J].針刺研究，2007，32（4）：234-236.

[11] Gan Y，Huang G，Zhang M.Effect of acupuncture on neuronal apoptosis after focal cerebral ischemic reperfusion Injury in Rats[J].World Journal of Acupuncture-Moxibustion，2007，17（3）：13-16.

（收稿日期：2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）endprint