大麻ISSR引物的篩選與細胞學制片技術的優化

張利國等

摘要：在穩定的ISSR-PCR擴增條件下，使用50個大麻ISSR引物對代表性的大麻材料進行PCR擴增，篩選出14個適合大麻的ISSR引物；同時，為優化大麻染色體的制片質量，對大麻染色體制片過程中的變溫預處理、低溫提高中期分裂相的方法及解離等具體技術與方法進行了試驗，優化后的大麻染色體制片條件為：芽長達1 cm后（21 ℃），23 ℃ 條件下促芽生長24 h，再低溫（0 ℃）處理24 h，37 ℃解離20 min（20 g/L纖維素酶和20 g/L果膠酶）。適合大麻ISSR-PCR反應的引物篩選與染色體制片技術的優化，將為大麻遺傳多樣性的多層次化分析提供試驗基礎。

關鍵詞：ISSR引物；大麻；染色體；制片技術

中圖分類號： S563.303 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0030-03

收稿日期：2013-08-13

基金項目：黑龍江省自然科學基金（編號：QC2012C115）；黑龍江省哈爾濱市青年科技創新人才項目（編號：2013RFQYJ014）。

作者簡介：張利國（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，助理研究員，從事麻類分子育種學研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

通信作者：張效霏。E-mail：14975487@qq.com。大麻起源于我國，大麻纖維公元前8世紀即有應用，是人類歷史上最早應用的纖維作物[1]，目前在紡織、建筑和醫藥上都有廣泛用途。國內主要是應用大麻纖維，大麻纖維具有吸濕、透氣、殺菌抑菌、無靜電等特點，且具有極強的抗紫外線功能，已成為重要的軍用紡織品原料。由于大麻是雌雄異株作物，遺傳資源極容易混雜，而且至今未能建立起有效的鑒別方法和標準[2]，給大麻的種質鑒定、擴大栽培等帶來不便。

ISSR可以在沒有任何分子生物學研究基礎的情況下，進行基因組指紋圖譜的構建。ISSR引物較長，因而對PCR反應的敏感性低于RAPD，穩定勝優于RAPD，具有較好的穩定性和多態性[3-5]。針對目前大麻遺傳學研究基礎薄弱、相關的SSR引物并未開發的現狀，ISSR標記技術是從分子水平研究大麻遺傳分化較合適的方法。ISSR標記可重復性明顯優于RAPD，但不如細胞學標記直觀和穩定，而細胞學的核型資料在種內相當穩定，直觀性好，說服力強，同時在研究植物的起源與進化上具有獨特的優勢[6]。綜合利用細胞遺傳學和 ISSR 技術來研究大麻遺傳多樣性，將有效地克服單一方法存在的局限，從各自的角度提供種間分化信息。

對于不同植物，其染色體壓片技術中的處理手段與處理時間各不相同。目前傳統的大麻制片方法是通過對二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙堿[7]等化學藥劑的作用，使染色體分裂相盡可能地停留在中期，但由于使用了化學藥劑，容易產生染色體的異常分裂、染色體斷片、丟失、形態上的扭曲等現象，不利于熒光原位雜交等后續試驗。同時，如果操作不當，易誘發人的細胞染色體突變，對長期制片工作者具有一定的損害。此外，這些方法在操作上效果有限，獲得大量中期分裂相難度較大，給大麻染色體分析帶來直接困難。

本研究在建立大麻ISSR-PCR反應體系的條件下，篩選出適合大麻的ISSR引物；同時采用日本京都大學細胞遺傳學家遠藤教授的植物染色體制片方法（該方法在小麥、亞麻、苧麻等作物上都取得了良好效果），結合大麻作物特點，優化大麻染色體制片條件。研究結果將為從細胞和分子水平綜合分析大麻遺傳起源、進化提供研究基礎，兩方面互相補充，將會有效克服單一方法存在的局限。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料黑龍江大麻地方品種Wuchang40以及代表性大麻資源K-16、K-20由黑龍江省農業科學院經濟作物研究所提供。ISSR分析采用哥倫比亞大學最新公布的50條引物。

1.2試驗方法

1.2.1篩選適合大麻的ISSR引物在前期工作中，反應體系各因素及梯度設計見表1。

3.2細胞學制片優化

制片的關鍵在于根尖材料的處理。本試驗通過變溫處理來提高根尖細胞的分裂指數，在21 ℃萌發后轉到8 ℃條件下培養40 h，再轉到23 ℃下培養24 h。不同大麻品種變溫處理具體要求可能會稍有變化，可隨時壓片鏡檢確定，原則上也就是在根尖生長最旺盛的時候取材。

冰水混合物（低溫冷處理）的作用是通過抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，因此凡進入中期的染色體均被阻遏而不進入分裂后期，這樣就可以累積大量的處于分裂中期的染色體。

本試驗采用24 h低溫處理，染色體長度適中，形態良好。在處理的過程中一定保證冰水混合物的狀態；并且處理時間不能過長，否則會導致染色體高度濃縮，不利于進一步分析。低溫處理的方法簡便易行，獲得的中期分裂相較多，效果良好，而且由于在整個制片過程中沒有使用化學藥劑，所以不會出現污染和因為前處理產生異常分裂現象，可為原位雜交等后續技術在大麻研究上的應用奠定試驗基礎。

大麻ISSR引物的篩選和高質量細胞學制片技術的優化，將為多層次、多角度研究大麻遺傳信息奠定基礎，包括研究大麻遺傳多樣性、物種起源和遺傳演化等。

參考文獻：

[1]關鳳芝. 大麻遺傳育種與栽培技術[M]. 哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010.

[2]張利國，關鳳芝，吳廣文，等. 基于核型與RAPD標記的大麻地方品種遺傳多樣性分析[J]. 中國麻業科學，2009，31（3）：169-172，181.

[3]陶愛芬，祁建民，粟建光，等. SRAP和ISSR及兩種方法結合在分析黃麻屬起源與演化上的比較[J]. 作物學報，2011，37（12）：2277-2284.

[4]汪斌，祁偉，蘭濤，等. 應用ISSR分子標記繪制紅麻種質資源DNA指紋圖譜[J]. 作物學報，2011，37（6）：1116-1123.

[5]張明，李延龍. 基于ISSR標記的韭菜種質資源遺傳多樣性初探[J]. 西北農業學報，2012，21（1）：146-150.

[6]Sheng Y，Zheng W H，Pei K Q，et al. Population genetic structure of a dominant desert tree，Haloxylon ammodendron（Chenopodiaceae）in the Southeast Gurbantunggut desert detected by RAPD and ISSR markers[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（6）：675-681.

[7]辛培堯.大麻染色體行為分析[J]. 西北植物學報，2008，28（11）：2189-2193.

摘要：在穩定的ISSR-PCR擴增條件下，使用50個大麻ISSR引物對代表性的大麻材料進行PCR擴增，篩選出14個適合大麻的ISSR引物；同時，為優化大麻染色體的制片質量，對大麻染色體制片過程中的變溫預處理、低溫提高中期分裂相的方法及解離等具體技術與方法進行了試驗，優化后的大麻染色體制片條件為：芽長達1 cm后（21 ℃），23 ℃ 條件下促芽生長24 h，再低溫（0 ℃）處理24 h，37 ℃解離20 min（20 g/L纖維素酶和20 g/L果膠酶）。適合大麻ISSR-PCR反應的引物篩選與染色體制片技術的優化，將為大麻遺傳多樣性的多層次化分析提供試驗基礎。

關鍵詞：ISSR引物；大麻；染色體；制片技術

中圖分類號： S563.303 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0030-03

收稿日期：2013-08-13

基金項目：黑龍江省自然科學基金（編號：QC2012C115）；黑龍江省哈爾濱市青年科技創新人才項目（編號：2013RFQYJ014）。

作者簡介：張利國（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，助理研究員，從事麻類分子育種學研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

通信作者：張效霏。E-mail：14975487@qq.com。大麻起源于我國，大麻纖維公元前8世紀即有應用，是人類歷史上最早應用的纖維作物[1]，目前在紡織、建筑和醫藥上都有廣泛用途。國內主要是應用大麻纖維，大麻纖維具有吸濕、透氣、殺菌抑菌、無靜電等特點，且具有極強的抗紫外線功能，已成為重要的軍用紡織品原料。由于大麻是雌雄異株作物，遺傳資源極容易混雜，而且至今未能建立起有效的鑒別方法和標準[2]，給大麻的種質鑒定、擴大栽培等帶來不便。

ISSR可以在沒有任何分子生物學研究基礎的情況下，進行基因組指紋圖譜的構建。ISSR引物較長，因而對PCR反應的敏感性低于RAPD，穩定勝優于RAPD，具有較好的穩定性和多態性[3-5]。針對目前大麻遺傳學研究基礎薄弱、相關的SSR引物并未開發的現狀，ISSR標記技術是從分子水平研究大麻遺傳分化較合適的方法。ISSR標記可重復性明顯優于RAPD，但不如細胞學標記直觀和穩定，而細胞學的核型資料在種內相當穩定，直觀性好，說服力強，同時在研究植物的起源與進化上具有獨特的優勢[6]。綜合利用細胞遺傳學和 ISSR 技術來研究大麻遺傳多樣性，將有效地克服單一方法存在的局限，從各自的角度提供種間分化信息。

對于不同植物，其染色體壓片技術中的處理手段與處理時間各不相同。目前傳統的大麻制片方法是通過對二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙堿[7]等化學藥劑的作用，使染色體分裂相盡可能地停留在中期，但由于使用了化學藥劑，容易產生染色體的異常分裂、染色體斷片、丟失、形態上的扭曲等現象，不利于熒光原位雜交等后續試驗。同時，如果操作不當，易誘發人的細胞染色體突變，對長期制片工作者具有一定的損害。此外，這些方法在操作上效果有限，獲得大量中期分裂相難度較大，給大麻染色體分析帶來直接困難。

本研究在建立大麻ISSR-PCR反應體系的條件下，篩選出適合大麻的ISSR引物；同時采用日本京都大學細胞遺傳學家遠藤教授的植物染色體制片方法（該方法在小麥、亞麻、苧麻等作物上都取得了良好效果），結合大麻作物特點，優化大麻染色體制片條件。研究結果將為從細胞和分子水平綜合分析大麻遺傳起源、進化提供研究基礎，兩方面互相補充，將會有效克服單一方法存在的局限。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料黑龍江大麻地方品種Wuchang40以及代表性大麻資源K-16、K-20由黑龍江省農業科學院經濟作物研究所提供。ISSR分析采用哥倫比亞大學最新公布的50條引物。

1.2試驗方法

1.2.1篩選適合大麻的ISSR引物在前期工作中，反應體系各因素及梯度設計見表1。

3.2細胞學制片優化

制片的關鍵在于根尖材料的處理。本試驗通過變溫處理來提高根尖細胞的分裂指數，在21 ℃萌發后轉到8 ℃條件下培養40 h，再轉到23 ℃下培養24 h。不同大麻品種變溫處理具體要求可能會稍有變化，可隨時壓片鏡檢確定，原則上也就是在根尖生長最旺盛的時候取材。

冰水混合物（低溫冷處理）的作用是通過抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，因此凡進入中期的染色體均被阻遏而不進入分裂后期，這樣就可以累積大量的處于分裂中期的染色體。

本試驗采用24 h低溫處理，染色體長度適中，形態良好。在處理的過程中一定保證冰水混合物的狀態；并且處理時間不能過長，否則會導致染色體高度濃縮，不利于進一步分析。低溫處理的方法簡便易行，獲得的中期分裂相較多，效果良好，而且由于在整個制片過程中沒有使用化學藥劑，所以不會出現污染和因為前處理產生異常分裂現象，可為原位雜交等后續技術在大麻研究上的應用奠定試驗基礎。

大麻ISSR引物的篩選和高質量細胞學制片技術的優化，將為多層次、多角度研究大麻遺傳信息奠定基礎，包括研究大麻遺傳多樣性、物種起源和遺傳演化等。

參考文獻：

[1]關鳳芝. 大麻遺傳育種與栽培技術[M]. 哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010.

[2]張利國，關鳳芝，吳廣文，等. 基于核型與RAPD標記的大麻地方品種遺傳多樣性分析[J]. 中國麻業科學，2009，31（3）：169-172，181.

[3]陶愛芬，祁建民，粟建光，等. SRAP和ISSR及兩種方法結合在分析黃麻屬起源與演化上的比較[J]. 作物學報，2011，37（12）：2277-2284.

[4]汪斌，祁偉，蘭濤，等. 應用ISSR分子標記繪制紅麻種質資源DNA指紋圖譜[J]. 作物學報，2011，37（6）：1116-1123.

[5]張明，李延龍. 基于ISSR標記的韭菜種質資源遺傳多樣性初探[J]. 西北農業學報，2012，21（1）：146-150.

[6]Sheng Y，Zheng W H，Pei K Q，et al. Population genetic structure of a dominant desert tree，Haloxylon ammodendron（Chenopodiaceae）in the Southeast Gurbantunggut desert detected by RAPD and ISSR markers[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（6）：675-681.

[7]辛培堯.大麻染色體行為分析[J]. 西北植物學報，2008，28（11）：2189-2193.

摘要：在穩定的ISSR-PCR擴增條件下，使用50個大麻ISSR引物對代表性的大麻材料進行PCR擴增，篩選出14個適合大麻的ISSR引物；同時，為優化大麻染色體的制片質量，對大麻染色體制片過程中的變溫預處理、低溫提高中期分裂相的方法及解離等具體技術與方法進行了試驗，優化后的大麻染色體制片條件為：芽長達1 cm后（21 ℃），23 ℃ 條件下促芽生長24 h，再低溫（0 ℃）處理24 h，37 ℃解離20 min（20 g/L纖維素酶和20 g/L果膠酶）。適合大麻ISSR-PCR反應的引物篩選與染色體制片技術的優化，將為大麻遺傳多樣性的多層次化分析提供試驗基礎。

關鍵詞：ISSR引物；大麻；染色體；制片技術

中圖分類號： S563.303 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0030-03

收稿日期：2013-08-13

基金項目：黑龍江省自然科學基金（編號：QC2012C115）；黑龍江省哈爾濱市青年科技創新人才項目（編號：2013RFQYJ014）。

作者簡介：張利國（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，助理研究員，從事麻類分子育種學研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

通信作者：張效霏。E-mail：14975487@qq.com。大麻起源于我國，大麻纖維公元前8世紀即有應用，是人類歷史上最早應用的纖維作物[1]，目前在紡織、建筑和醫藥上都有廣泛用途。國內主要是應用大麻纖維，大麻纖維具有吸濕、透氣、殺菌抑菌、無靜電等特點，且具有極強的抗紫外線功能，已成為重要的軍用紡織品原料。由于大麻是雌雄異株作物，遺傳資源極容易混雜，而且至今未能建立起有效的鑒別方法和標準[2]，給大麻的種質鑒定、擴大栽培等帶來不便。

ISSR可以在沒有任何分子生物學研究基礎的情況下，進行基因組指紋圖譜的構建。ISSR引物較長，因而對PCR反應的敏感性低于RAPD，穩定勝優于RAPD，具有較好的穩定性和多態性[3-5]。針對目前大麻遺傳學研究基礎薄弱、相關的SSR引物并未開發的現狀，ISSR標記技術是從分子水平研究大麻遺傳分化較合適的方法。ISSR標記可重復性明顯優于RAPD，但不如細胞學標記直觀和穩定，而細胞學的核型資料在種內相當穩定，直觀性好，說服力強，同時在研究植物的起源與進化上具有獨特的優勢[6]。綜合利用細胞遺傳學和 ISSR 技術來研究大麻遺傳多樣性，將有效地克服單一方法存在的局限，從各自的角度提供種間分化信息。

對于不同植物，其染色體壓片技術中的處理手段與處理時間各不相同。目前傳統的大麻制片方法是通過對二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙堿[7]等化學藥劑的作用，使染色體分裂相盡可能地停留在中期，但由于使用了化學藥劑，容易產生染色體的異常分裂、染色體斷片、丟失、形態上的扭曲等現象，不利于熒光原位雜交等后續試驗。同時，如果操作不當，易誘發人的細胞染色體突變，對長期制片工作者具有一定的損害。此外，這些方法在操作上效果有限，獲得大量中期分裂相難度較大，給大麻染色體分析帶來直接困難。

本研究在建立大麻ISSR-PCR反應體系的條件下，篩選出適合大麻的ISSR引物；同時采用日本京都大學細胞遺傳學家遠藤教授的植物染色體制片方法（該方法在小麥、亞麻、苧麻等作物上都取得了良好效果），結合大麻作物特點，優化大麻染色體制片條件。研究結果將為從細胞和分子水平綜合分析大麻遺傳起源、進化提供研究基礎，兩方面互相補充，將會有效克服單一方法存在的局限。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料黑龍江大麻地方品種Wuchang40以及代表性大麻資源K-16、K-20由黑龍江省農業科學院經濟作物研究所提供。ISSR分析采用哥倫比亞大學最新公布的50條引物。

1.2試驗方法

1.2.1篩選適合大麻的ISSR引物在前期工作中，反應體系各因素及梯度設計見表1。

3.2細胞學制片優化

制片的關鍵在于根尖材料的處理。本試驗通過變溫處理來提高根尖細胞的分裂指數，在21 ℃萌發后轉到8 ℃條件下培養40 h，再轉到23 ℃下培養24 h。不同大麻品種變溫處理具體要求可能會稍有變化，可隨時壓片鏡檢確定，原則上也就是在根尖生長最旺盛的時候取材。

冰水混合物（低溫冷處理）的作用是通過抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，因此凡進入中期的染色體均被阻遏而不進入分裂后期，這樣就可以累積大量的處于分裂中期的染色體。

本試驗采用24 h低溫處理，染色體長度適中，形態良好。在處理的過程中一定保證冰水混合物的狀態；并且處理時間不能過長，否則會導致染色體高度濃縮，不利于進一步分析。低溫處理的方法簡便易行，獲得的中期分裂相較多，效果良好，而且由于在整個制片過程中沒有使用化學藥劑，所以不會出現污染和因為前處理產生異常分裂現象，可為原位雜交等后續技術在大麻研究上的應用奠定試驗基礎。

大麻ISSR引物的篩選和高質量細胞學制片技術的優化，將為多層次、多角度研究大麻遺傳信息奠定基礎，包括研究大麻遺傳多樣性、物種起源和遺傳演化等。

參考文獻：

[1]關鳳芝. 大麻遺傳育種與栽培技術[M]. 哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010.

[2]張利國，關鳳芝，吳廣文，等. 基于核型與RAPD標記的大麻地方品種遺傳多樣性分析[J]. 中國麻業科學，2009，31（3）：169-172，181.

[3]陶愛芬，祁建民，粟建光，等. SRAP和ISSR及兩種方法結合在分析黃麻屬起源與演化上的比較[J]. 作物學報，2011，37（12）：2277-2284.

[4]汪斌，祁偉，蘭濤，等. 應用ISSR分子標記繪制紅麻種質資源DNA指紋圖譜[J]. 作物學報，2011，37（6）：1116-1123.

[5]張明，李延龍. 基于ISSR標記的韭菜種質資源遺傳多樣性初探[J]. 西北農業學報，2012，21（1）：146-150.

[6]Sheng Y，Zheng W H，Pei K Q，et al. Population genetic structure of a dominant desert tree，Haloxylon ammodendron（Chenopodiaceae）in the Southeast Gurbantunggut desert detected by RAPD and ISSR markers[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（6）：675-681.

[7]辛培堯.大麻染色體行為分析[J]. 西北植物學報，2008，28（11）：2189-2193.