抵擋湯對糖尿病模型大鼠下肢血管病變影響研究

高悉航，牟淑敏

（1.山東中醫(yī)藥大學第一臨床學院2011級碩士研究生，山東 濟南 250014；2.山東省中醫(yī)院內分泌科，山東 濟南 250011）

糖尿病下肢血管病變（vascular disease of lower extremities，VDLE）是2型糖尿病（T2DM）常見并發(fā)癥之一，常可造成肢端壞疽［1］，有研究表明，ICAM-1及VCAM-1等粘附分子的過度表達與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與有關［2］。我們以辛伐他汀及羅格列酮作為陽性對照藥物，觀察抵擋湯對DM大鼠一般狀況、血糖變化、下肢動脈VCAM-1、ICAM-1表達的影響，探討防治T2DM血管病變的作用機制。

1 藥物與試劑

鏈脲佐菌素（STZ）為美國Sigma公司生產，細胞間粘附分子1（ICAM-1）（BA2189）購自武漢博士德公司，血管細胞間粘附分子1（VCAM-1）（SC-8304）購自Santa Cruz公司，馬來酸羅格列酮（文迪雅）為葛蘭素史克公司生產，辛伐他汀為杭州默沙東制藥有限公司生產。抵擋湯（桃仁10g，水蛭10g，虻蟲10g，大黃6g）藥物購于山東中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，按傳統(tǒng)工藝制備水煎劑，減壓濃縮至濃度為1g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 動物及分組

健康Wistar大鼠100只，雄性，1月齡，質量（100.36±2.28）g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供（動物合格證號為SCXK魯2005015）。隨機抽取20只作為正常對照組，其余80只作為糖尿病造模組，給予高脂飼料。實驗12周后，糖尿病組大鼠尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）30mg/kg造模，72h后尾靜脈采血測血糖高于16.7mmol/L確定造模成功。除去造模未成功2只后隨機分為抵擋湯組19只、辛伐他汀組20只、羅格列酮組19只和模型對照組20只。

3 實驗方法

藥物干預方法：抵擋湯組按照大鼠等效劑量予抵擋湯生藥2.30g/（kg·d）灌胃,辛伐他汀組和羅格列酮組分別按1.80mg/（kg·d）和0.36mg/（kg·d）給藥。動物自由飲水，繼續(xù)原方法喂養(yǎng)至24周實驗結束取血取材。

標本獲取：實驗于24周時結束，各組大鼠股動脈放血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆茫糜谏笜藴y定。頸椎脫臼處死大鼠并解剖，取放血對側股動脈，以4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色和免疫組化檢測。

觀察指標：石蠟切片與免疫組化測定：將留取的股動脈以4%多聚甲醛固定，洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、片厚5 um，SP法免疫組化染色，用計算機-圖像分析儀將免疫組化載玻片圖像通過圖像采集系統(tǒng)以40×物鏡輸入，采用Image-Pro Plus5.0對圖象中的陽性反應部位進行IOD分析。

統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據采用SPSSl6.0統(tǒng)計軟件包分析，數(shù)據用樣本均數(shù)±標準差（）表示，采用方差分析和Dunnet’s T3檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

4 實驗結果

各組血糖比較見表1。

表1 各組大鼠血糖比較 （mmol/L ，）

表1 各組大鼠血糖比較 （mmol/L ，）

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，△P<0.05。

組別 例數(shù) 血糖（mmol/l）第13周 第16周 第24周正常對照組 20 5.3±1.2 6.0±1.3 5.9±1.1模型對照組 20 27.9±3.6* 28.3±4.4* 27.7±3.1*抵擋湯組 19 27.3±6.6 25.4±8.3 26.1±8.3辛伐他汀組 20 28.0±2.7 27.3±6.6 26.1±7.3羅格列酮組 19 28.0±3.5* 15.0±3.6*△ 11.0±3.6*△

各組大鼠股動脈免疫組化ICAM-1和VCAM-1檢測結果見表2。

表2 各組大鼠股動脈VCAM-1、ICAM-1免疫組化IOD值比較（）

表2 各組大鼠股動脈VCAM-1、ICAM-1免疫組化IOD值比較（）

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，△P<0.05。

組別 例數(shù) VCAM-1 ICAM-1正常對照組 20 73.0±5.2 105.5±11.6模型對照組 20 743.0±53.1* 935.3±58.2*抵擋湯組 19 647.0±47.8*△ 846.8±57.4*△辛伐他汀組 20 650.7±40.9*△ 798.5±48.3*△羅格列酮組 19 637.0±55.6*△ 759.2±51.5*△

5 討 論

VDLD病變特點主要是動脈粥樣硬化和中膜鈣化［3］。隨著分子免疫學的研究進展，越來越多的證據顯示動脈粥樣硬化過程是一個慢性炎癥過程。有研究表明，高血糖可使NF-κB活化促進許多炎癥基因（如粘附分子）的表達增加［4］。細胞粘附分子（cell adhesion molecule，CAM）是一類調節(jié)細胞與細胞、細胞與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）間相互結合、起粘附作用的細胞表面跨膜糖蛋白。其中血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是研究最多的與動脈粥樣硬化相關的粘附分子。

糖尿病血管病變臨床常見，其病理基礎是糖尿病的糖脂代謝異常導致的動脈粥樣硬化、中小動脈硬化狹窄、缺血缺氧所致的微循環(huán)灌注障礙。本病屬中醫(yī)“脈痹”、“無脈證”等范疇。病機為瘀血阻絡。治療當以活血通絡法為主。抵擋湯出自東漢張仲景《傷寒雜病論》，由大黃、桃仁、虻蟲、水蛭組成，具有活血通絡、逐瘀攻下功效。實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠下肢動脈高度表達ICAM-1及VCAM-1，而抵擋湯可以明顯抑制血管ICAM-1及VCAM-1的表達，通過抑制血管ICAM- 1及VCAM-1的表達，發(fā)揮防治糖尿病性動脈硬化的作用。

［1］Deshpande AD，Harris-Hayes M，Schootman M.Epidemiology of diabetes and diabetes-related complications［J］.Phys Ther，2008，88（11）：1254-1264.

［2］Hwang SJ，Ballantyne CM，Sharrett AR，et al.Circulating adhesion molecules VCAM-1，ICAM-1 and E-selectin in carotid atherosclerosis and incident coronary heart disease：The Atherosclerosis Risk In Communities （AR1C） study ［J］.Circulation，1997，96（12）：4219-4225.

［3］湯紹芳，衛(wèi)紅艷，張鵬.IL-6啟動子基因多態(tài)性與2型糖尿病下肢血管病變的關系［J］.中國全科醫(yī)學，2010，5（13）：1531-1534.

［4］Fang L，Wei H Mark KH，et al.Marker of low-grade inflammation and soluble cell adhension molecules in Chinese patients with coronary artery disease ［J］.Cardiol，2004，20（14）：1433-1438.