響應曲面法優化金絲桃素提取工藝的研究

薛曉麗等

摘要：優化從貫葉連翹粗提取物中提取金絲桃素的工藝條件。在單因素試驗基礎上，采用響應曲面法，以金絲桃素的提取率為響應值，通過回歸分析各工藝參數與響應值之間的關系，預測最佳提取工藝條件。結果表明：金絲桃素最佳提取條件為：浸提溫度80 ℃，浸提時間 105 min，液料比 75 mL ∶1 g，甲醇體積分數85%，比條件下提取率為 372%。驗證試驗證明此法合理高效，預測準確，方便可行。

關鍵詞：響應曲面法；金絲桃素；提取；工藝條件優化

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0221-03

收稿日期：2013-08-27

基金項目：長白山動植物資源利用與保護吉林省高校重點實驗室2012年一般基金（編號：吉農院合字[2012]第706號）。

作者簡介：薛曉麗（1970—），女，吉林永吉人，碩士，高級實驗師，主要從事天然產物化學的教學與科研工作。E-mail：lilyxue4222@hotmail.com。金絲桃素屬駢苯二蒽酮類物質，分子式C30H16O8，廣泛分布于貫葉金絲桃（Hypericum perforatum）、烏腺金絲桃（H. attenuatum）、長柱金絲桃（H. ascyron）等植物中。近年來，金絲桃素在抗腫瘤的光化學治療、抗病毒（包括HIV）、抗抑郁機制研究等方面十分活躍。已有研究表明，金絲桃素作為有效的光敏劑，通過光動力學治療可以有效地誘導腫瘤細胞凋亡，臨床上已用于治療基體細胞癌、胰腺癌、膀胱癌甚至腦瘤等[1-4]。另外，近年來大量試驗已證明，金絲桃素為廣譜抗病毒的中草藥活性單體，對多種畜禽傳染病有良好防治效果。已有不少文獻報道了用金絲桃素防治豬高熱病、雞新城疫、鴨病毒性肝炎等[5-9]的事例，使其成為繼紅豆杉、人參和銀杏葉之后，國內外研究的又一個熱點，在新藥開發上具有重大意義[10]。金絲桃素具有特殊理化性質及其在光和熱的作用下易分解、易氧化變質的特性，故其提取率和產品純度都較低，制約了其深入研究和制藥工藝的發展。本試驗以甲醇為溶劑，采用易于工業化生產的熱浸提取方法，以金絲桃素提取率為考察指標，以提取時間、液固比、提取溫度、甲醇體積分數為提取工藝的主要影響因素，通過單因素試驗確定影響較大的3個因素，采用響應曲面法（response surface methodology）進行優化，確定從貫葉連翹粗提物中提取金絲桃素的最佳工藝。響應曲面法是目前廣泛應用于天然產物中有效化學成分提取工藝優化的一種數據處理方法[11-13]，具有簡便、試驗精度高的優點，使用該方法優化后的的金絲桃素提取率有明顯的提高，為金絲桃素提取的工業化生產提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試材料為貫葉連翹粗粉，購于西安康培基生物科技有限公司。材料陰干至恒重，備用。金絲桃素對照品，購于上海融禾醫藥科技有限公司，純度>98%。

試劑包括甲醇、石油醚，均購于天津永大化學試劑有限公司，去離子水由實驗室自制。

1.2儀器

紫外分光光度計（島津 UV-2450）；恒溫水浴鍋（金壇醫療儀器廠HH-S4）；分析天平（梅特勒 AL204）；超純水機（密理博-Q3）等。

1.3方法

1.3.1金絲桃素提取將貫葉連翹粗粉陰干樣品過20目篩，用石油醚在55 ℃脫脂3 次，干燥備用。精確稱取一定量樣品，加入到一定量、一定體積分數的甲醇溶液中，置于一定溫度的水浴鍋中，浸提一定時間后，離心，定容。將提取液稀釋10倍后，置紫外分光光度計中590 nm下檢測吸光度。每個試驗3次平行，取平均值，結果以提取率（E）表示。E=[（C×V）/m]×f×100%，式中：C為金絲桃素的質量濃度（μg/mL）；V為加入溶劑的體積（mL）；m為樣品的質量（g）；f為稀釋倍數。

1.3.2標準曲線繪制精確稱取金絲桃素對照品5.1 mg，加入到甲醇定容至25 mL的容量瓶中，搖勻，配成質量濃度為0.204 mg/mL的對照品溶液，將此溶液稀釋10倍后做為標準母液。準確量取適量標準母液，定容至10 mL容量瓶中，配成濃度為1.280～20.40 μg/mL的標準溶液。置紫外分光光度計中590 nm下檢測吸光度，繪制標準曲線，得回歸曲線y=0.599 2x+0.248 7，r2=0.999 9。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1液固比對金絲桃素提取率的影響在溫度80 ℃、甲醇體積分數85%、提取時間110 min的條件下，考察液固比25 ∶1～125 ∶1（mL/g）對提取率的影響，結果如圖1所示。

2.1.2提取溫度對金絲桃素提取率影響在液固比 75 mL ∶1 g、甲醇體積分數85%、提取時間110 min的條件下，考察提取溫度60、70、75、80、85 ℃對金絲桃素提取率的影響，結果見圖2。由圖2可以看出，在80 ℃之前，隨溫度的升高，金絲桃素提取率不斷增加，在80 ℃時提取率達到最大；80 ℃ 后提取率迅速下降。主要是由于溫度過高，金絲桃素迅速分解，使提取率大大下降，因此選擇提取溫度為80 ℃。

2.1.3提取時間對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL ∶1 g、提取溫度80 ℃、甲醇體積分數85%的條件下，考察提取時間50、70、90、110、130 min對金絲桃素提取率的影響，結果見圖3。由圖3可以看出，金絲桃素提取率隨提取時間延長而逐漸增加，在提取110 min時達到最大值，隨后減小。這可能是由于提取時間過長，金絲桃素有部分分解，另外一些糖類和蛋白質雜質慢慢溶出，使得溶液黏度增大，金絲桃素被吸附在固體基質上而不易被提取出來。因此應選擇 110 min 作為最佳的提取時間。endprint

2.1.4甲醇體積分數對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL∶1 g、提取時間110 min、提取溫度80 ℃的條件下，考察甲醇體積分數70%、75%、80%、85%、90%、95%對提取率的影響，結果見圖4。由圖4可知，金絲桃素在甲醇體積分數85%時提取率最高。主要與樣品中有很多極性不同的化合物有關，不同化合物最適合的溶劑極性各不相同。因此，金絲桃素提取率會隨著甲醇體積分數的增加先增大后減小，因此，甲醇體積分數以85%為最佳。

2.2響應曲面法優化金絲桃素的提取工藝

2.2.1響應曲面試驗設計及結果為優化金絲桃素的提取工藝條件，采用經典的3因素3水平 Box-Behnken Design（BBD）試驗設計。在單因素試驗基礎上，精確稱取 0.200 g 貫葉連翹粗提物于具塞塑料管中，選取對金絲桃素提取率有較大影響的提取時間（A）、提取溫度（B）、甲醇體積分數（C）3因素進行優化。具體方案及結果見表1、表2。

2.2.3響應曲面分析由圖5可以看出，提取率隨提取溫度的變化幅度較大，其次是提取時間變化對提取率的影響，而甲醇體積分數的變化對提取率的影響幅度較平緩?？梢?，提取溫度對提取率的影響最為顯著。通過優化分析，最佳的提取條件為：提取溫度78.8 ℃，甲醇體積分數87.5%，提取時間103.78 min，液固比75 mL ∶1 g，預測金絲桃素提取率為372%。但考慮到實際操作的局限性，將金絲桃素的提取工藝修正為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分數90%，提取時間 105 min，液固比75 mL ∶1 g。在此條件下提取3次，金絲桃素的平均提取率為3.714%，與預測值基本相符，證實了該方程的準確性和實用性。

3結論

采用單因素試驗及響應曲面法對金絲桃素提取工藝條件進行優化，通過回歸分析建立相關性良好的方程，得到的最佳的提取工藝為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分數90%，提取時間105 min，液固比75 mL ∶1 g。試驗值與預測值相符，證實該方程的準確性和實用性。

需要注意的是，在配制金絲桃素標準溶液時應注意其不易溶及見光易分解的問題，操作時要求操作者能熟練掌握儀器的使用及藥品的配制。

參考文獻：

[1]高麗芳，孟艷，趙雪儉，等. 光活化的金絲桃素對人前列腺癌細胞 PC3M的生長抑制作用[J]. 吉林大學學報：醫學版，2004，30（1）：97-99.

[2]王曉利，劉金釧，張俊松，等. 光源對金絲桃素光動力體外抗腫瘤作用的影響[J]. 華西藥學雜志，2008，23（1）：47-49.

[3]王曉利，王彩虹，郭懿，等. 光誘導金絲桃素對人鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用和凋亡研究[J]. 中成藥，2010，32（8）：1296-1300.

[4]王曉利，張俊松，劉金釧，等. 貫葉金絲桃中金絲桃素提取物對人肺癌細胞A549的體外殺傷效應[J]. 中成藥，2007，29（7）：1058-1061.

[5]王玲，索朗斯珠，馬俊英.金絲桃素的提取分離及其藥理活性研究現狀[J]. 動物醫學進展，2005，26（5）：32-35.

[6]胡冬華，高穎，邵琛，等. 貫葉連翹有效成分金絲桃素與HIV逆轉錄酶相互作用的研究[J]. 分子科學學報，2008，24（4）：280-283.

[7]曲曉波，蘇忠民，胡冬華，等. 金絲桃素分子結構及其與HIV病毒蛋白酶作用的分子動力學研究[J]. 高等學校化學學報，2009，30（7）：1402-1405.

[8]周廣生. 中藥金絲桃素口服液防治雞新城疫的試驗[J]. 上海畜牧獸醫通訊，2008（6）：65.

[9]周廣生. 中藥金絲桃素口服液治療鴨病毒性肝炎的試驗研究[J]. 中國畜牧獸醫，2008，35（12）：128-129.

[10]湯國祥. 使用金絲桃素聯合用藥治療豬高熱病[J]. 湖南農業大學學報：自然科學版，2009，10（增刊1）：129-130.

[11]孔濤，范杰平，胡小芳，等. 響應面法優化超聲輔助提取車前草中的熊果酸[J]. 食品科學，2011（6）：80-84.

[12]肖衛華，韓魯佳，楊增玲，等. 響應面法優化黃芪黃酮提取工藝的研究[J]. 中國農業大學學報，2007，12（5）：52-56.

[13]胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等. 響應面法優化云芝多糖提取條件的研究[J]. 食品工業科技，2007，7（7）：124-126，130.endprint

2.1.4甲醇體積分數對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL∶1 g、提取時間110 min、提取溫度80 ℃的條件下，考察甲醇體積分數70%、75%、80%、85%、90%、95%對提取率的影響，結果見圖4。由圖4可知，金絲桃素在甲醇體積分數85%時提取率最高。主要與樣品中有很多極性不同的化合物有關，不同化合物最適合的溶劑極性各不相同。因此，金絲桃素提取率會隨著甲醇體積分數的增加先增大后減小，因此，甲醇體積分數以85%為最佳。

2.2響應曲面法優化金絲桃素的提取工藝

2.2.1響應曲面試驗設計及結果為優化金絲桃素的提取工藝條件，采用經典的3因素3水平 Box-Behnken Design（BBD）試驗設計。在單因素試驗基礎上，精確稱取 0.200 g 貫葉連翹粗提物于具塞塑料管中，選取對金絲桃素提取率有較大影響的提取時間（A）、提取溫度（B）、甲醇體積分數（C）3因素進行優化。具體方案及結果見表1、表2。

2.2.3響應曲面分析由圖5可以看出，提取率隨提取溫度的變化幅度較大，其次是提取時間變化對提取率的影響，而甲醇體積分數的變化對提取率的影響幅度較平緩。可見，提取溫度對提取率的影響最為顯著。通過優化分析，最佳的提取條件為：提取溫度78.8 ℃，甲醇體積分數87.5%，提取時間103.78 min，液固比75 mL ∶1 g，預測金絲桃素提取率為372%。但考慮到實際操作的局限性，將金絲桃素的提取工藝修正為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分數90%，提取時間 105 min，液固比75 mL ∶1 g。在此條件下提取3次，金絲桃素的平均提取率為3.714%，與預測值基本相符，證實了該方程的準確性和實用性。

3結論

采用單因素試驗及響應曲面法對金絲桃素提取工藝條件進行優化，通過回歸分析建立相關性良好的方程，得到的最佳的提取工藝為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分數90%，提取時間105 min，液固比75 mL ∶1 g。試驗值與預測值相符，證實該方程的準確性和實用性。

需要注意的是，在配制金絲桃素標準溶液時應注意其不易溶及見光易分解的問題，操作時要求操作者能熟練掌握儀器的使用及藥品的配制。

參考文獻：

[1]高麗芳，孟艷，趙雪儉，等. 光活化的金絲桃素對人前列腺癌細胞 PC3M的生長抑制作用[J]. 吉林大學學報：醫學版，2004，30（1）：97-99.

[2]王曉利，劉金釧，張俊松，等. 光源對金絲桃素光動力體外抗腫瘤作用的影響[J]. 華西藥學雜志，2008，23（1）：47-49.

[3]王曉利，王彩虹，郭懿，等. 光誘導金絲桃素對人鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用和凋亡研究[J]. 中成藥，2010，32（8）：1296-1300.

[4]王曉利，張俊松，劉金釧，等. 貫葉金絲桃中金絲桃素提取物對人肺癌細胞A549的體外殺傷效應[J]. 中成藥，2007，29（7）：1058-1061.

[5]王玲，索朗斯珠，馬俊英.金絲桃素的提取分離及其藥理活性研究現狀[J]. 動物醫學進展，2005，26（5）：32-35.

[6]胡冬華，高穎，邵琛，等. 貫葉連翹有效成分金絲桃素與HIV逆轉錄酶相互作用的研究[J]. 分子科學學報，2008，24（4）：280-283.

[7]曲曉波，蘇忠民，胡冬華，等. 金絲桃素分子結構及其與HIV病毒蛋白酶作用的分子動力學研究[J]. 高等學校化學學報，2009，30（7）：1402-1405.

[8]周廣生. 中藥金絲桃素口服液防治雞新城疫的試驗[J]. 上海畜牧獸醫通訊，2008（6）：65.

[9]周廣生. 中藥金絲桃素口服液治療鴨病毒性肝炎的試驗研究[J]. 中國畜牧獸醫，2008，35（12）：128-129.

[10]湯國祥. 使用金絲桃素聯合用藥治療豬高熱病[J]. 湖南農業大學學報：自然科學版，2009，10（增刊1）：129-130.

[11]孔濤，范杰平，胡小芳，等. 響應面法優化超聲輔助提取車前草中的熊果酸[J]. 食品科學，2011（6）：80-84.

[12]肖衛華，韓魯佳，楊增玲，等. 響應面法優化黃芪黃酮提取工藝的研究[J]. 中國農業大學學報，2007，12（5）：52-56.

[13]胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等. 響應面法優化云芝多糖提取條件的研究[J]. 食品工業科技，2007，7（7）：124-126，130.endprint

2.1.4甲醇體積分數對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL∶1 g、提取時間110 min、提取溫度80 ℃的條件下，考察甲醇體積分數70%、75%、80%、85%、90%、95%對提取率的影響，結果見圖4。由圖4可知，金絲桃素在甲醇體積分數85%時提取率最高。主要與樣品中有很多極性不同的化合物有關，不同化合物最適合的溶劑極性各不相同。因此，金絲桃素提取率會隨著甲醇體積分數的增加先增大后減小，因此，甲醇體積分數以85%為最佳。

2.2響應曲面法優化金絲桃素的提取工藝

2.2.1響應曲面試驗設計及結果為優化金絲桃素的提取工藝條件，采用經典的3因素3水平 Box-Behnken Design（BBD）試驗設計。在單因素試驗基礎上，精確稱取 0.200 g 貫葉連翹粗提物于具塞塑料管中，選取對金絲桃素提取率有較大影響的提取時間（A）、提取溫度（B）、甲醇體積分數（C）3因素進行優化。具體方案及結果見表1、表2。

2.2.3響應曲面分析由圖5可以看出，提取率隨提取溫度的變化幅度較大，其次是提取時間變化對提取率的影響，而甲醇體積分數的變化對提取率的影響幅度較平緩?？梢?，提取溫度對提取率的影響最為顯著。通過優化分析，最佳的提取條件為：提取溫度78.8 ℃，甲醇體積分數87.5%，提取時間103.78 min，液固比75 mL ∶1 g，預測金絲桃素提取率為372%。但考慮到實際操作的局限性，將金絲桃素的提取工藝修正為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分數90%，提取時間 105 min，液固比75 mL ∶1 g。在此條件下提取3次，金絲桃素的平均提取率為3.714%，與預測值基本相符，證實了該方程的準確性和實用性。

3結論

采用單因素試驗及響應曲面法對金絲桃素提取工藝條件進行優化，通過回歸分析建立相關性良好的方程，得到的最佳的提取工藝為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分數90%，提取時間105 min，液固比75 mL ∶1 g。試驗值與預測值相符，證實該方程的準確性和實用性。

需要注意的是，在配制金絲桃素標準溶液時應注意其不易溶及見光易分解的問題，操作時要求操作者能熟練掌握儀器的使用及藥品的配制。

參考文獻：

[1]高麗芳，孟艷，趙雪儉，等. 光活化的金絲桃素對人前列腺癌細胞 PC3M的生長抑制作用[J]. 吉林大學學報：醫學版，2004，30（1）：97-99.

[2]王曉利，劉金釧，張俊松，等. 光源對金絲桃素光動力體外抗腫瘤作用的影響[J]. 華西藥學雜志，2008，23（1）：47-49.

[3]王曉利，王彩虹，郭懿，等. 光誘導金絲桃素對人鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用和凋亡研究[J]. 中成藥，2010，32（8）：1296-1300.

[4]王曉利，張俊松，劉金釧，等. 貫葉金絲桃中金絲桃素提取物對人肺癌細胞A549的體外殺傷效應[J]. 中成藥，2007，29（7）：1058-1061.

[5]王玲，索朗斯珠，馬俊英.金絲桃素的提取分離及其藥理活性研究現狀[J]. 動物醫學進展，2005，26（5）：32-35.

[6]胡冬華，高穎，邵琛，等. 貫葉連翹有效成分金絲桃素與HIV逆轉錄酶相互作用的研究[J]. 分子科學學報，2008，24（4）：280-283.

[7]曲曉波，蘇忠民，胡冬華，等. 金絲桃素分子結構及其與HIV病毒蛋白酶作用的分子動力學研究[J]. 高等學校化學學報，2009，30（7）：1402-1405.

[8]周廣生. 中藥金絲桃素口服液防治雞新城疫的試驗[J]. 上海畜牧獸醫通訊，2008（6）：65.

[9]周廣生. 中藥金絲桃素口服液治療鴨病毒性肝炎的試驗研究[J]. 中國畜牧獸醫，2008，35（12）：128-129.

[10]湯國祥. 使用金絲桃素聯合用藥治療豬高熱病[J]. 湖南農業大學學報：自然科學版，2009，10（增刊1）：129-130.

[11]孔濤，范杰平，胡小芳，等. 響應面法優化超聲輔助提取車前草中的熊果酸[J]. 食品科學，2011（6）：80-84.

[12]肖衛華，韓魯佳，楊增玲，等. 響應面法優化黃芪黃酮提取工藝的研究[J]. 中國農業大學學報，2007，12（5）：52-56.

[13]胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等. 響應面法優化云芝多糖提取條件的研究[J]. 食品工業科技，2007，7（7）：124-126，130.endprint