CHL1在腦膠質細胞瘤中表達的臨床意義

由慶軍 杜依燃

CHL1在腦膠質細胞瘤中表達的臨床意義

由慶軍 杜依燃

目的研究CHL1在腦膠質細胞瘤中表達的臨床意義。方法采用RT-PCR和Western blot檢測腦膠質細胞瘤原發組織和瘤旁組織中CHL1的表達, 分析其與臨床病理因素關系。結果CHL1在腦膠質細胞瘤原發瘤組織中的表達低于相應的瘤旁組織。結論為研究腦膠質細胞瘤發生和進展提供了策略。

腦膠質細胞瘤；CHL1；臨床意義

腦膠質細胞瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤, 具有侵襲性生長, 無控性增殖, 易復發的特點［1,2］。其本質上是一種多基因異常疾病, 通過原癌基因的過表達, 同時伴隨抑癌基因的突變缺失, 從而使腫瘤細胞逃避了正常生長的調控機制。傳統治療方法(包括手術、化療和放療)并沒有完全解決膠質細胞瘤侵襲性生長所導致的高復發率和低治愈率難題。由此, 從根本上糾正與腦膠質細胞瘤發生、發展相關的基因異常的基因治療已成為醫學研究領域的熱點［3］。

神經系統發育和再生過程中, 細胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAM)是介導細胞與細胞, 細胞與細胞外基質間相互識別、粘附和信號轉導的重要信號分子［4,5］。 CAM主要分為四大類：免疫球蛋白超家族、鈣粘素、整合素和選擇素。CHL1基因定位于3q26上, 屬于細胞粘附分子免疫球蛋白超家族, 集中表達于神經系統。目前關于CHL1與腫瘤的關系已引起人們的重視。Y.Li等［6］研究發現, CHL1促進乳腺癌細胞的粘附和遷移, 但是不促進侵襲。N.Gavert等［7］在結腸癌中研究發現, CHL1介導結腸癌細胞的轉移不需要上皮細胞的間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和腫瘤樣干細胞表型發生變化。但是目前對于CHL1在腦膠質細胞瘤中表達的臨床意義的研究尚未見報道。

本研究中, 作者檢測了100例腦膠質細胞瘤患者的原發組織及相應的瘤旁組織標本的CHL1表達情況。結果表明：CHL1在腦膠質細胞瘤組織中低表達, 在癌旁組織相對高表達, 并且在mRNA轉錄水平和蛋白表達水平相一致。CHL1 mRNA表達量與臨床分期、組織學分級、腫瘤大小、淋巴結狀態等因素相關。因此, CHL1為深入研究腦膠質細胞瘤的分子病理機制以及臨床治療提供新線索和策略, 有望成為腦膠質細胞瘤早期診斷和預測預后的生物分子標志物。

1 材料與方法

1.1腫瘤標本 100例腦膠質細胞瘤組織標本均取自2005年9月~2012年1月吉林市中心醫院收治的腦膠質細胞瘤患者, 所有病例術前均未行放療和化療。組織樣本經液氮速凍后-80℃保存。所有樣本采集和使用均征得患者同意并簽署知情同意書后由吉林市中心醫院倫理委員會同意使用。

1.2細胞總RNA的提取 采用TRAZOL一步法快速提取細胞總RNA。將腦膠質細胞瘤組織樣本加入液氮在研缽中磨碎, 加3~5 ml Trizol試劑, 室溫作用30 min后懸液分裝于1.5 ml EP管中, 每管1 ml；待組織細胞消化完全后于每個EP管中加入氯仿(200 μl/1 ml Trizol), 顛倒混勻, 12, 000×g 4℃離心20 min； 吸取上層水相, 移至另一干凈的EP管中,分別加入異丙醇(0.5 ml/1 mlTrizol)混勻。-20℃沉淀2 h, 12000×g 4℃離心20 min；棄上清, 75%乙醇洗滌RNA 沉淀3次；用真空泵抽干RNA沉淀, 加入DEPC水溶解RNA, 65℃助溶5~10 min；用微量核酸定量分析儀檢測RNA濃度和純度, 較純的RNA OD260/OD280的值在1.5~2.0之間。取1 μg RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量, 完整的RNA其28 S與18 S的條帶亮度比值應為2：1。實時熒光定量PCR。

1.3cDNA的合成 20 μl SuperScriptTMII體系中包括5 μg總RNA, 0.5 μg Oligo (dT), 10 nmol dNTP mix, 65℃變性5 min,冰浴后加入First-Strand Buffer, 0.2 μmol DTT和40 U RNA酶抑制劑, 37℃溫育2 min后加入M-MLV 200 U, 37℃反應50 min。反應完成后70℃, 15 min終止反應。

1.4熒光定量PCR反應 采用Oligo6.0軟件設計引物和探針序列, 引物及探針均由上海生工生物工程公司合成。實時熒光定量PCR, 20 μl反應體系中包括由40 ng總RNA反轉錄所得的cDNA, 10 μl Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG, 10 μmol/L的上下游引物和TaqMan探針各0.4 μl。PCR反應條件為50℃ 溫育2 min, 95℃預變性3 min, 95℃變性30 s, 60℃退火延伸1 min, 40個循環。CT值為熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數。每個樣本中每個基因的檢測均重復3次。CT值為熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數,△CT值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差, 2-△CT則為該樣本中CHL1相對于GAPDH mRNA的表達量。

1.5Western blot 制備4%濃縮膠和10%分離膠的聚丙烯酰胺垂直平板凝膠, 40 μg總蛋白經80伏電壓電泳3 h后,電轉70伏3 h轉印至PVDF膜。含5% ECL blocking agent的TBS-T(pH 8.3)室溫封閉1 h后加入一抗, 4℃平搖過夜, TBS-T洗膜6次后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗, 室溫孵育1 h, TBS-T洗膜6次, 加ECL Western blotting Detection Reagents顯色1~2 min, 曝光X膠片。用BIO-RAD ChemiDocXRS凝膠成像系統照相。一抗：兔抗人CHL1(Abcam公司)；二抗：辣根過氧化物酶標記的抗兔(Santa Cruz公司, 美國)。

1.6統計學方法 選擇分組患者預后達到敏感性和特異性最佳值的mRNA水平作為閾值, 分別將腦膠質細胞瘤病例分類為CHL1mRNA高表達組和低表達組, 統計學分析用SPSS 16.0統計軟件。計數資料采用χ2檢驗, P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CHL1在腦膠質細胞瘤組織和配對的正常組織差異表達作者采用RT-PCR和Western blot 檢測100例同時收集腦膠質細胞瘤和配對瘤旁正常腦組織病例中CHL1 mRNA和蛋白表達, 結果表明：患者的腦膠質細胞瘤原發組織中 CHL1表達量較配對瘤旁正常腦組織下調3倍以上, χ2檢驗證實腦膠質細胞瘤原發組織中較配對瘤旁正常腦組織中表達差異有統計學意義(P=0.019 ), 見圖1A、B。

圖1 RT-PCR和Western blot 檢測腦膠質細胞瘤原發組織和配對瘤旁組織中CHL1表達量差異。A)CHL1 mRNA在配對腦良、惡性組織中的表達水平差異。B)CHL1蛋白在配對腦良、惡性組織中的表達水平差異。

2.2CHL1 表達與臨床病理因素的關系 CHL1 mRNA表達量與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結狀態等因素相關。CHL1 mRNA在臨床分期III、II期組較I期組表達降低, 差異具有統計學意義(χ2= 7.08, P=0.026)；在腫瘤T2 (2~5 cm)、T3 (> 5 cm)組低于T1(≤2 cm)組, 差異具有統計學意義(χ2=7.76, P=0.021)；隨著淋巴結陽性數目增加而表達降低(χ2=13.01, P=0.001)；CHL1 mRNA在組織學分級III期組較I+II期組表達降低, 差異具有統計學意義(χ2=6.07, P=0.014)。表達量與年齡無明顯相關性(P=0.750), 見表1。

表1 CHL1 mRNA表達水平與臨床病理各因素的關系

3 討論

神經系統發育和再生過程中, 細胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAM)是介導細胞與細胞, 細胞與細胞外基質間相互識別、粘附和信號轉導的重要信號分子［4］。CHL1在腫瘤中的作用也逐漸得到重視。A.Thies等［8］對惡性黑色素瘤、皮膚正常組織研究發現, CHL1與轉移有關。A.Rokman 等［9］研究發現, CHL1在前列腺癌中作為易感基因定位于3p26。E.N.Manderson等［10］對于CHL1同源性基因分子遺傳分析發現, 卵巢癌中CHL1同contactin 6和 contactin 4 共同位于3p26, 是腫瘤抑制基因。N.Gavert等［11］研究發現, 在浸潤性結腸癌中, CHL1是β-catenin 信號通路的新靶點。

CHL1參與許多神經系統腫瘤的發生。但是關于CHL1在腦膠質細胞瘤中表達的臨床意義的研究尚未見報道。本研究中作者發現患者的腦膠質細胞瘤原發組織中 CHL1表達量較配對瘤旁正常腦組織下調3倍以上, CHL1 mRNA表達量與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結狀態等因素相關。CHL1mRNA在臨床分期III、II期組較I期組表達降低, 差異具有統計學意義。結果證明在腦膠質細胞瘤原發組織中CHL1低表達, CHL1 mRNA表達量與臨床分期、組織學分級、腫瘤大小、淋巴結狀態等因素相關。作者的結果是否作為診斷患者的生物分子指標有待進一步證明。

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Clinical significance of CHL1 in glioma tumorigenesis express

YOU Qing-jun, DU Yi-ran.Jilin Central Hospital, Jilin 132011, China

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of CHL1 in glioma patients.MethodsRT-PCR and Western blot were used to examine the expression of CHL1 in samps, including 100 normal tissues and 30 primary tumors.ResultsCHL1 was low-regulated in glioma and related to LN.ConclusionOur results may provide a strategy for blocking glioma and progression.

Glioma tumorigenesis; CHL1; Clinical significance

132011 吉林省吉林市中心醫院神經外科