地龍的定性鑒別及蛋白質含量測定

卓 燊 廖澤勇

地龍的定性鑒別及蛋白質含量測定

卓 燊2廖澤勇1

目的 對地龍進行定性鑒別及蛋白質含量測定。方法采用顯微、薄層色譜法對地龍進行定性鑒別，采用紫外分光光度法對其蛋白質含量進行測定。結果蛋白質在0.02～0.10mg/m l范圍內線性關系良好，在50min內穩定性良好，測得地龍蛋白質含量為2.33mg/g，儀器精密度RSD為0.627 %。結論利用顯微及薄層鑒別，可對地龍藥材進行定性鑒別及含量測定，蛋白質含量采用紫外測定方法簡便可行。

地龍；定性鑒別；蛋白質；

地龍（Geosaurus）為環節動物門鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretimaas pergilum（E Perrier）、威廉環毛蚓P guillelmi（M ichaelsen）、櫛肓毛蚓P pectinifera M ichaelsen或通俗環毛蚓P vulgarisChen的干燥體。前一種習稱“廣地龍”，后三種習稱“瀘地龍”，主產于福建、廣東、廣西等地；性寒，味咸；功效為清熱定驚，平肝熄風，通絡利尿平喘；用于關節麻痹，高熱神昏，肢體麻木，驚癇抽搐，半身不遂，肺熱喘咳等。

地龍化學成分種類繁多，結構復雜，多為高分子有機化合物[1-2]，主要化學成分為蛋白質類。蛋白質、氨基酸類成分可通過電泳分析、儀器分析等方法進行含量測定；而目前化學成分、藥理等方面的研究相對較少。近年有研究使用地龍治療支氣管哮喘、癲癇發作、腮腺炎、高血壓、消化性潰瘍等而獲效的報道，是中醫藥治療心腦血管疾病、高熱驚厥、支氣管哮喘的良藥[3]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器HH-6恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）；顯微鏡BA-200（廈門麥克奧迪有限公司）；UV-紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；電子天平、離心機、KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑地龍（廣州致信中藥飲片有限公司）；地龍對照藥材（昆明雙星科技開發有限公司）；考馬斯亮藍G-250；牛血清白蛋白；試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 地龍的顯微分析按照2010版中國藥典的方法，將地龍藥材進行粉碎處理，取少量粉末置于載玻片上，滴加水合氯醛，加熱透化，再滴加稀甘油裝片，在顯微鏡（目鏡6×，物鏡40×）下觀察，實驗結果如圖1。

地龍粉末呈灰黃色，顯微鏡實驗結果：①剛毛呈黃棕色或淡棕色，前端多頓圓，表面或可見縱裂紋；②斜紋肌纖維，淡棕色或無色，散離或相互交結，彎曲或稍平直，邊緣常不平整；③表皮黃棕色，細胞界限明顯，暗棕色色素顆粒散在或聚成網狀。

2.2 地龍的薄層分析

2.2.1 方法一 取地龍粉末 3g，加乙醇 30m l，水浴加熱回流 30min，放冷濾過，濾液蒸干，殘渣加水10m l使溶解，用石油醚15m l振搖萃取，分取石油醚層，置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇1m l使溶解，作為供試品溶液。另取地龍對照藥材0.3g，加乙醇10m l，同法制得對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9.0:0.5）為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，實驗結果如圖2所示。

2.2.2 方法二 取地龍粉末3g，加氯仿30m l，超聲處理 3min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加氯仿1m l溶解，作為供試品溶液。另取地龍對照藥材0.3g，加氯仿10m l，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（9:1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢測，實驗結果如圖3～4所示。

圖1 地龍粉末顯微圖

圖2-4 10%硫酸-乙醇顯色TLC圖(溫度：20℃，濕度：65%)

圖2為供試品與對照藥材在相應的位置上顯相同紫紅顏色的主斑點。圖3～4在365nm紫外熒光檢測下，供試品與對照藥材在相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點；10 %硫酸-乙醇溶液薄層板上，供試品與對照藥材在相應位置上顯相同顏色的斑點。

2.3 地龍的蛋白質檢測取地龍粉末 3g，用冷水30m l浸提（每毫升含原藥材100mg），適當濃縮后，取浸提液點樣于硅膠 G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4:1:5）（上層）為展開劑，展開，取出晾干，噴以0.5%茚三酮溶液顯色，實驗結果如圖5所示。

地龍薄層分析顯紫紅至深藍斑點，表明地龍藥材中含有大量蛋白質氨基酸類成分。

圖5 0.5%茚三酮溶液顯色TLC圖

2.4 地龍的蛋白質含量測定

2.4.1 供試液的制備 稱取地龍藥材30g，加10倍量水，浸泡40min，煎煮3次，每次60min，過濾后合并濾液，將濾液濃縮至適量，放置過夜，離心，定容成50m l備用[4-5]。

2.4.2 對照品及試劑的配制 牛血清白蛋白標準液：稱取50mg牛血清白蛋白，加50m l蒸餾水容成1mg/m l溶液。考馬斯亮藍 G-250蛋白試液：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50m l 95%乙醇中，加入85%的磷酸100m l，用蒸餾水定容成1000m l[6]。

2.4.3 線性關系考察 在各試管中分別加入濃度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/m l的蛋白質溶液，再各加入5m lG-250試劑充分搖勻，放置2min后在595nm波長下測定吸光值。以標準蛋白質濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線為 Y=4.8214X+0.0034，R2=0.9997，表明標準蛋白質在0.02～0.10mg/m l范圍內線性關系良好（表1）。

表1 蛋白溶液標準曲線

2.4.4 精密度測定 精密吸取 0.6mg/m l的牛血清白蛋白溶液100μl，加入5m l G-250試劑充分搖勻，放置2min后在595nm波長下測定吸光值。連續測定6次。實驗結果RSD為0.627%，表明儀器精密度良好（表2）。

2.4.5 穩定性考察 精密吸取0.6mg/m l的牛血清白蛋白溶液100μl，加入5m l G-250試劑充分搖勻，放置2min后在595nm波長下測定吸光值。每10min測一次，測定50min內的吸光度。實驗結果RSD為2.57%，表明蛋白質溶液在50min內性質穩定（表3）。

表2 精密度測定

表3 穩定性考察

2.4.6 樣品含量測定 于3支試管中分別準確加入已稀釋10倍的0.1m l樣品蛋白液，再各加5m l考馬斯亮蘭G-250試劑，充分混合，放置2min后，以標準曲線0號試管做參比，在595nm波長下測定吸光值。計算得出蛋白質含量（表4）。

經樣品含量測定，地龍水溶性蛋白質的含量（以牛血清白蛋白計）為2.33mg/g。

表4 樣品含量測定結果

3 小結

本研究顯示，利用顯微鑒別法和薄層鑒別法可對地龍藥材進行定性鑒別及含量測定，蛋白質含量采用紫外測定方法簡便可行。

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[5] 李廷利,李玉萍,馮翰.地龍的化學成分與臨床應用概況[J].黑龍江醫藥,2006,19(4):303-304.

[6] 邱葵,司天潤.用考馬斯亮藍測定動物藥材中可溶性蛋白質含量方法初探[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(4):49-50.

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Qualitative Identification and Determ ination of Protein Content of Geosaurus

Zhuo Shen Liao Zeyong

Ob jec tive To do qua litative identification and determ ination of p rotein content of Geosaurus.MethodsWe used the m icroscopy、TLC and UV spectrophotometry methods to prove the identification and determ ine the p rotein o f Geosaurus.Resu ltThe p rotein was linear in the range of 0.02～0.10m g/m l.The stability of p rotein was fine in 50m in.The protein content of geosaurus was 2.33mg/g and RSD was 0.627%.Conc lusionUse of the methods of m icroscopy、TLC can identify Geosaurus.UV m ethods o f p rotein content o f Geosaurus is easy and feasib le.

Geosaurus;Qualitative Identification;Protein

R927.2

A

1673-5846(2014)05-0018-03

1廣西藥用植物園，廣西南寧 530023

2廣西科技大學醫學院，廣西柳州 545005

卓燊（1975-），主管中藥師，碩士研究生，研究方向：中藥藥效與理論。

廖澤勇（1984-），初級研究員，碩士研究生，研究方向：中藥藥效學。