中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的影響※

李厚忠 張羽飛

中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的影響※

李厚忠1張羽飛2

目的 確定中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的作用及機制。方法建立哮喘模型小鼠并且將小鼠隨機分為三組，即模型組（OVA致敏的小鼠）、中藥川貝組（中藥川貝治療的小鼠）和PBS組（正常對照組的小鼠），中藥川貝組小鼠分別給予中藥川貝（9.0g/kg）。對模型小鼠的氣道炎癥、血管生成、血管內皮生長因子（VEGF）和缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）進行研究。結果與哮喘模型組小鼠相比，中藥川貝組可以改善過敏性氣道炎癥，并顯著減少血管百分比，也降低VEGF和HIF-1α的表達。血管百分比與VEGF和HIF-1α表達呈正相關，同時VEGF和HIF-1α表達呈正相關。結論結果表明，中藥川貝具有重要的抑制哮喘模型小鼠血管生成作用。中藥川貝通過抑制VEGF和HIF-1α表達實現(xiàn)抗血管生成活性。

血管生成；哮喘；中藥川貝；血管內皮生長因子；缺氧誘導因子-1α

哮喘患者肺組織常伴有新生血管的生成，哮喘患者活組織檢查發(fā)現(xiàn)，不論血管的數量還是粗細均有所增加，這些改變可引起氣道阻塞和（或）氣道高反應性，從而加重哮喘[1]。目前治療哮喘的一般方法是應用糖皮質激素、白三烯受體拮抗藥物等[2]，由于不良反應嚴重，患者很難接受，那么尋找安全有效的中藥就顯得更加重要。中藥川貝治療哮喘安全可靠，可作為首選。

以往有研究表明，血管內皮細胞生長因子（VEGF）在血管生成過程中起核心作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，VEGF調節(jié)血管生成是通過缺氧誘導因子-1α（HIF- 1α）實現(xiàn)的[4]，HIF-1α可以調節(jié)基因表達響應氧氣濃度的變化。在本研究中建立哮喘小鼠模型，通過檢測氣道炎癥、血管百分比以及血管生成與VEGF和HIF-1α的關系，主要評價中藥川貝治療哮喘的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試藥中藥川貝粉的制備：選取整齊、粉性足者。由于川貝忌水洗，為去除藥材表面的灰塵，可采用潔凈的紗布擦拭藥材表面。凈選后的川貝通過滅菌消毒窗消毒15min后直接轉至粉碎車間，用Fz-400型粉碎機組加工成100目細粉，收得細粉裝入潔凈的容器中，封口。全部加工完后的細粉用潔凈的塑料袋分裝成1kg/袋備用。

1.2 實驗動物雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號為P00102008。

1.3 模型建立健康清潔級 BALB/C小鼠腹腔內注射10%卵蛋白+10%氫氧化鋁混合液1m l作為首次致敏，第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%卵蛋白生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，隔日一次，一次 20m in，共激發(fā) 28d。以小鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩(wěn)等現(xiàn)象表示成功激發(fā)。將成功制備的哮喘模型小鼠（20只）隨機分為兩組（每組10只）。分別為模型組和中藥川貝組，另設PBS組（10只以生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射及霧化吸入給藥）。分組后每天灌胃給藥，模型組和PBS組給予等量生理鹽水，中藥川貝組給予川貝粉9.0g/kg，每天1次，連續(xù)28d。最后1次給藥2h后，三組小鼠應用1%巴比妥鈉麻醉，取出肺組織保存，待用于組織學檢測。

1.4 組織學分析肺組織采用 4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、數字顯微鏡掃描。根據組織學評分系統(tǒng)對支氣管周圍炎癥進行評分：①支氣管周圍無炎細胞；②可見少量炎細胞；③大量炎細胞，但未完全浸潤支氣管；④1層炎細胞完全浸潤支氣管；⑤2層炎細胞完全浸潤支氣管；⑥3層或更多炎細胞完全浸潤支氣管。使用所有肺組織的支氣管除以有炎癥的支氣管計算平均支氣管炎癥指數。

1.5 免疫組化法檢測VEGF和HIF-1α表達及計算血管百分比肺組織石蠟切片、脫蠟、脫水、浸泡于3% H2O2中15min滅活內源性過氧化物酶。置于煮沸檸檬酸鈉中修復抗原，暴露抗原表位并且用3%小牛血清蛋白阻斷。切片與血管性血友病因子（vWF）初級抗體孵育。VEGF和HIF-1α分別于4℃過夜，隨后與二氨基聯(lián)苯胺孵育。用均勻結合在內皮細胞表面的 vWF抗體標記血管，所有的后續(xù)步驟均在ZSGB-BIO Autostainer進行。隨機選定一個 HPF（200×）視野，像場的總面積除以vWF陽性面積即得血管百分比，免疫組化染色支氣管上皮細胞用于計算VEGF和HIF-1α表達。

1.6 Western blotting檢測VEGF和HIF-1α表達在蛋白酶抑制劑的存在下肺組織勻漿，以獲得肺蛋白提取物，用于Western blotting分析，使用bca-100蛋白定量分析試劑盒確定濃度。每組蛋白質等量（30μg）固定SDS聚丙烯酰胺凝膠，然后轉移至硝酸纖維素膜，膜在三異丙基乙磺酰緩沖鹽水吐溫20（25mM Tris pH 7.5，150mM NaCl和0.1% Tween 20）中用5%的脫脂奶粉封閉1h，與原發(fā)性抗VEGF抗體或抗-HIF-1抗體4℃過夜孵育，然后與二抗雜交（Dako,1:2000），增強化學發(fā)光顯示特異性結合，以 β-Actin為內參，X射線掃描，計算機輔助雙向光密度計分析光密度，計算VEGF和HIF- 1α表達的相對比例。

1.7 統(tǒng)計分析計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和 Mann Whitney檢驗相關數據的分布。VEGF和HIF-1α表達與血管百分比的相關性采用Spearman檢驗評價。P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 中藥川貝改善過敏性氣道炎癥組織學分析顯示，模型組呈典型哮喘病理特征（圖1A）。許多炎細胞浸潤支氣管周圍，支氣管上皮增厚，與PBS組比較炎癥指標明顯增強，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。給予中藥川貝干預后，氣道炎癥明顯改善，炎細胞減少，支氣管上皮增厚范圍縮小（圖1B），與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

圖1 小鼠肺組織組織病理學切片(200×)

表1 三組哮喘模型小鼠血管生成影響的指標情況比較[(±s),n=10]

表1 三組哮喘模型小鼠血管生成影響的指標情況比較[(±s),n=10]

注：模型組與PBS組比較**P＜0.01；中藥川貝組與模型組比較※※P＜0.01，※P＜0.05

指標 模型組 中藥川貝組 PBS組平均炎癥指數 4.79±0.21※※ 2.91±0.17** 1.60±0.15血管百分比 2.82±0.78※※ 0.77±0.13** 0.42±0.10 VEGF表達 93.29±1.55※※26.25±1.08** 23.08±2.79 VEGF表達相對比 2.08±0.30※※ 1.12±0.22** 0.96±0.30 HIF-1α表達 89.60±0.79※※71.70±1.40** 11.70±0.30 HIF-1α表達相對比 0.97±0.30※ 0.88±0.47** 0.32±0.12

2.2 中藥川貝降低血管生成OVA致敏后，血管生成（圖2）。模型組血管百分比明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。給予中藥川貝干預后，血管百分比明顯降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

圖2 小鼠肺組織vWF陽性血管面積(200×)

2.3 中藥川貝降低VEGF表達模型組支氣管上皮細胞，肺泡上皮細胞和內皮細胞VEGF表達明顯升高，中藥川貝干預后，VEGF表達接近PBS組（圖3，表1）。Western blotting結果顯示，在模型組VEGF表達明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中藥川貝干預后，VEGF表達降低，與PBS組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4和表1。

圖3 小鼠肺組織VEGF表達(200×)

圖4 Western blotting結果

2.4 中藥川貝降低HIF-1α表達為進一步闡明中藥川貝抗血管生成機制，本實驗還檢測了肺組織HIF-1α表達水平。PBS組僅可見少量HIF-1α陽性細胞，而在模型組肺泡上皮細胞核HIF-1α高表達（圖4～5）。Western blotting檢測HIF-1α相對比，結果顯示模型組HIF-1α表達上調，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中藥川貝組HIF-1α表達下調，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

圖5 小鼠肺組織HIF-1α表達(400×)

2.5 血管百分比與VEGF和HIF-1α表達相關性 Western blotting結果顯示（圖4），血管百分比與VEGF（r = 0.693，P＜0.01）和HIF-1α（r = 0.785，P＜0.01）表達程正相關，因此VEGF和HIF-1α表達呈正相關（r = 0.641，P＜0.05)。

3 討論

為闡明中藥川貝抗血管形成機制，本研究檢測了平均炎細胞指數和血管百分比。哮喘模型小鼠肺組織可見大量炎細胞浸潤支氣管周圍，同時支氣管上皮細胞損傷，炎癥是哮喘加重的一個重要因素[5]。炎癥效應細胞（肥大細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞等）是血管形成的主要誘因，這與哮喘患者血管生成增多相一致[6-8]，哮喘模型小鼠血管百分比明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥川貝不僅可以改善氣道炎癥，而且還可以減少血管生成，結果證實中藥川貝具有抗血管生成作用。

本研究證實了VEGF和HIF-1α表達的關系。近年研究表明，VEGF的激活受HIF-1α調控，哮喘發(fā)作時HIF-1α表達增加，從而使VEGF表達上調，最終引起血管生成增加，這與文獻結果相一致。

在哮喘模型小鼠還發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細胞，肺泡內皮細胞和血管內皮細胞VEGF表達增加，此結果明確了VEGF表達和血管百分比之間的關系。眾所周知，在血管生成過程中，VEGF起核心作用[9]。中藥川貝降低降低VEGF表達，抑制內皮細胞增殖和血管生成，最終降低血管百分比，VEGF表達降低可能是中藥川貝抗血管生成的機制之一。

終上所述，中藥川貝可以減輕氣道炎癥，降低VEGF和HIF-1α表達，從而抑制哮喘模型小鼠肺組織血管生成，本研究支持中藥川貝支持治療人類哮喘的良好作用。

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The Effects of Bulbus Fritillariae Cirrhosae on Angiogenesis in a M urine Asthma model

Li Houzhong Zhang Yufei

Ob jec tive The aim of this study is to determ ine the effects and mechanism s of Bulbus Fritillariae Cirrhosae on angiogenesis in a murine asthma mode l.MethodsA m ouse m odel o f asthm a was estab lished and the m ice were random ly divided into three groups,nam ely the m odel group (OVA sensitized m ice),Chinese m edicine group (TCM Chuanbei Chuanbei treated m ice) and group PBS (norm al control group m ice),Chinese m edicine fritillary bu lb group m ice were given traditiona l Chinese m edicine Fritillary (9.0g/kg). Airway inflamm ation, blood vessel formation,vascular endothelial grow th factor on model m ice (VEGF) and hypoxia inducible factor -1α (HIF-1α) stud.Resu ltsAdm inistration o f Bu lbus Fritillariae Cirrhosae am eliorated allergic airway inflamm ation and significantly reduced the percentage vascu larity com pared w ith those in the asthm atic mode l m ice.It a lso reduced the expression of HIF-1α,as we ll as that o f VEGF.Percentage vascularity had positive corre lation w ith both HIF-1α and VEGF expression.Furtherm ore,there is positive re lationship between HIF-1α and VEGF exp ression.Conc lusionThe results demonstrate that Bulbus Fritillariae Cirrhosae has an im portant inhibitoryeffect on angiogenesis in asthma. Inhaled adm inistration o f Bulbus Fritillariae Cirrhosae achieved anti-angiogenic activity through inhibition of HIF-1α and VEGF expression.

Angiogenesis;Bu lbus Fritillariae Cirrhosae;Asthm a;VEGF;HIF-1α

R285.5

A

1673-5846(2014)05-0193-03

1牡丹江醫(yī)學院藥學院，黑龍江牡丹江 157011

2牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江 157011

牡丹江醫(yī)學院科學技術研究項目（編號：2010-34）

李厚忠（1979-），黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)人，碩士，主要從事藥理學和毒理學研究。

張羽飛（1981-），碩士，主要從事男性生殖研究工作。E-mail：yufeizhang@foxmail.com。