CRISPR-Cas介導(dǎo)的基因編輯工具

左其生 李東 張亞妮 李碧春

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

隨著分子高通量測序、基因芯片和RNA-seq技術(shù)的產(chǎn)生、發(fā)展，復(fù)雜基因組中未知基因功能的探索對(duì)生物學(xué)的定點(diǎn)研究、臨床醫(yī)學(xué)及基因治療都有著不可替代的前景和作用。從人們對(duì)基因功能探索開始，研究者就利用DNA損傷修復(fù)的天然機(jī)制（自然重組）來實(shí)現(xiàn)靶基因的定點(diǎn)修飾，然而自然情況下重組效率極低，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，致使后續(xù)試驗(yàn)不能順利進(jìn)行。經(jīng)過科研工作者的不斷探索，獲得了一些對(duì)基因組中特定位點(diǎn)的基因進(jìn)行靶向敲除或敲入的方法，并取得一定的成效。近年來，人工核酸內(nèi)切酶（Engineered endonuclease，EEN）方法的出現(xiàn)使基因靶向敲除變得簡單，同時(shí)也提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。ENN能夠通過特異性的核酸序列介導(dǎo)，利用核酸內(nèi)切酶對(duì)特異性的DNA位點(diǎn)進(jìn)行酶切，產(chǎn)生雙鏈斷裂切口（double strand breaks，DSB），當(dāng)DNA損傷時(shí)，細(xì)胞為防止DNA降解啟動(dòng)DNA的自我修復(fù)機(jī)制：同源重組（homologous recombination，HR）和非同源末端重組（Non-homologous end joining，NHEJ），對(duì)斷裂的雙鏈核酸進(jìn)行修復(fù)。非同源末端重組修復(fù)過程極易產(chǎn)生堿基丟失，錯(cuò)配，在修復(fù)過程中會(huì)產(chǎn)生不等數(shù)目的堿基缺失或者插入，進(jìn)而改變基因的密碼子閱讀框，使得翻譯后的蛋白質(zhì)的功能出現(xiàn)差異甚至失活。精準(zhǔn)的基因靶向修飾可以清楚的了解目的基因的功能，有利于深入了解疾病的發(fā)生機(jī)制并制定相應(yīng)的治療方案。目前應(yīng)用比較廣泛的ENN主要有鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN），然而這兩種技術(shù)的設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)過程也較繁瑣，而作為第3代ENN技術(shù)的Cas9/gRNA系統(tǒng)則是這兩年興起的一種快速基因靶向敲除技術(shù)，因其具有實(shí)驗(yàn)過程簡單、耗時(shí)短和工作量小等優(yōu)勢，正逐漸地取代ZFN和TALEN技術(shù)。目前研究人員已經(jīng)利用Cas9系統(tǒng)在小鼠、斑馬魚和果蠅等動(dòng)物中成功的構(gòu)建了基因敲除模型，并在HEK293和iPS等細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因的敲除并產(chǎn)生了穩(wěn)定的細(xì)胞株，實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)修飾及其功能研究。因此，本文就Cas9系統(tǒng)的作用原理、設(shè)計(jì)步驟及其應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)的綜述。

1 CRISPR-Cas的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)及作用原理

規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中獲得一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，通過小片段的RNA介導(dǎo)對(duì)入侵的核酸進(jìn)行靶向定位并通過Cas酶對(duì)核酸進(jìn)行酶切、降解［1]。研究者根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的特性對(duì)此系統(tǒng)進(jìn)行改造產(chǎn)生了第3代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)。利用此技術(shù)能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行靶向的敲除（Knock out）或敲入（Konck in）。

1.1 CRISPR-Cas的發(fā)現(xiàn)

1987年，日本學(xué)者在研究細(xì)菌中編碼堿性磷酸酶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，在這個(gè)基因的編碼區(qū)附近有一小段DNA片段包含了大量的重復(fù)序列［2]，直到2002年，科學(xué)家才將其正式命名為 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）［3]。研究發(fā)現(xiàn)，大約有40%的細(xì)菌中含有CRISPR位點(diǎn)，但是不同細(xì)菌種屬在該位點(diǎn)的基因序列具有特異性［4]。2005年，科研人員發(fā)現(xiàn)CRISPR中的重復(fù)序列與細(xì)菌的外源核酸入侵的免疫過程有關(guān)，其功能類似于真核生物的RNAi干擾方式。此后，科研人員陸續(xù)的探索了CRISPR的功能和機(jī)制，并將其應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，使之成為繼ZFN和TALEN之后的又一重要的基因靶向修飾技術(shù)。

1.2 CRISPR/Cas9 的結(jié)構(gòu)

CRISPR是一種特殊的DNA序列重復(fù)家族，是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中產(chǎn)生的一種特異性免疫防御機(jī)制。CRISPR-Cas主要分為I、II、III 3個(gè)類型，Type I系統(tǒng)分布于細(xì)菌和古細(xì)菌中，組分復(fù)雜，核心蛋白元件為Cas3 蛋白，該蛋白具有DNA核酸酶和解旋酶功能，在防御外源核酸入侵時(shí)，多個(gè)Cas蛋白與crRNA形成復(fù)合物CASCAD（CRISPR associated complex for antivirus defense），在crRNA的介導(dǎo)下與外源核酸特異性結(jié)合，Cas3啟動(dòng)核酸酶作用，對(duì)外源核酶進(jìn)行酶切，降解。Type II系統(tǒng)主要分布于細(xì)菌中，尤其是產(chǎn)鏈膿桿菌。該系統(tǒng)組分簡單，核心蛋白元件為Cas9蛋白，Cas9蛋白與成熟的crRNA結(jié)合形成復(fù)合物即可對(duì)外源的核酸進(jìn)行酶切，降解。Type III系統(tǒng)主要分布于古細(xì)菌中，在細(xì)菌中比較少見。該系統(tǒng)的核心蛋白元件為Cas10，其作用于Type I的CASCAD類似，主要參與crRNA的成熟以及外源核酸的降解。根據(jù)系統(tǒng)的靶標(biāo)對(duì)象的不同可將Type III分為Type III A和Type III B，前者的靶標(biāo)對(duì)象為mRNA，后者為DNA［5]。

由于II型CRISPR的系統(tǒng)組分相對(duì)簡單，因此目前研究多集中于II型CRISPR系統(tǒng)。II型CRISPR/Cas的組成，如圖1所示，首先是5'端的tracrRNA，此tracrRNA能夠與3'端的spacers序列轉(zhuǎn)錄剪切成熟后的crRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈RNA，tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶標(biāo)的特定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA；其次是Cas蛋白的編碼序列 Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，不同的亞型蛋白分別在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中發(fā)揮不同的作用，其中Cas9具有核酸酶的作用。Cas9包含HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和RuvC-like 結(jié)構(gòu)域，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域能夠剪切與crRNA互補(bǔ)的序列而RuvC-like 結(jié)構(gòu)域則剪切非互補(bǔ)的序列；3'端為CRISPR 基因座，由啟動(dòng)子區(qū)域和眾多的重復(fù)序列（21-48 bp左右，序列并不嚴(yán)格保守）和間隔序列組成，重復(fù)序列中的回文序列在Cas蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物的過程中起著重要的作用。間隔序列決定了CRISPR系統(tǒng)的特異性，間隔序列的差異來源于外源入侵的噬菌體和質(zhì)粒，一般在21-72 bp，不同的間隔序列能夠記錄不同的噬菌體或者質(zhì)粒的入侵的時(shí)間和順序。

圖1 II型CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的作用原理

任何一種生命體都可以通過某一RNA介導(dǎo)的防御機(jī)制來保護(hù)自身的基因組免受外源核酸的干擾和破壞，如真核生物中miRNA干擾現(xiàn)象，CRISPR-Cas系統(tǒng)則是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中產(chǎn)生的特異的免疫防御機(jī)制，當(dāng)外源核酸入侵時(shí)對(duì)其靶向定位并進(jìn)行降解，其作用過程主要分為3步：首先CRISPR間隔序列的獲得和整合；其次，CRISPR基因座的表達(dá)；再次，CRISPR-Cas功能的發(fā)揮，即對(duì)外源核酸的干擾［6]。

當(dāng)噬菌體或者外源質(zhì)粒初次入侵時(shí)，其核酸的一小段DNA片段將被動(dòng)的整合到宿主的基因組中，整合部位位于 CRRSPR的5'端的初始的重復(fù)序列中形成間隔序列，而噬菌體或質(zhì)粒中與之對(duì)應(yīng)的序列則為原間隔序列（Protospacer），而原間隔序列的5'端和3'端延伸的幾個(gè)序列是非常保守的，稱之為原間隔序列臨近基序（Protospacer adjacent motifs，PAM），PAM的一般形式為NGG，其作用是將間隔序列定位于入侵的噬菌體或質(zhì)粒的DNA序列中，即宿主對(duì)入侵的外源核酸進(jìn)行掃描，在其DNA序列中定位若干個(gè)PAM，并將PAM 5'端或3'的序列定義為新的原間隔序列并被剪切后陸續(xù)的整合到CRRSPR系統(tǒng)5'端新合成的兩個(gè)重復(fù)序列之間（圖2）。間隔序列的產(chǎn)生與Cas2的功能是分不開的，大量研究發(fā)現(xiàn)所有的CRISPR系統(tǒng)中都含有 Cas2基因編碼區(qū)，表明Cas2在CRISPR系統(tǒng)作用的過程中起著非常重要的作用，研究結(jié)果也表明Cas2參與了新的原間隔序列的形成。

正常情況下細(xì)菌中的CRISPR的表達(dá)水平較低且相對(duì)恒定。當(dāng)噬菌體或外源質(zhì)粒再次入侵時(shí)，CRISPR會(huì)被迅速的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。重復(fù)序列和間隔序列在前導(dǎo)序列的啟動(dòng)下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄形成pre-crRNA，pre-crRNA通過剪切形成成熟的cr-RNA。cr-RNA由兩部分組成即間隔序列和側(cè)翼的部分重復(fù)序列。cr-RNA與tracrRNA形成雙鏈的RNA，對(duì)入侵的外源核酸進(jìn)行靶向的定位并介導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)外源核酸進(jìn)行切割降解。目前發(fā)現(xiàn)并非只有cr-RNA與外源DNA完全匹配的才會(huì)被酶切，隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，研究表明Cas9技術(shù)在實(shí)驗(yàn)過程中存在脫靶效應(yīng)，即cr-RNA與外源DNA不完全匹配的情況下序列也有可能被酶切。

圖2 II型CRISPR-Cas系統(tǒng)原間隔序列形成過程

2 Cas9/gRNA的體外構(gòu)建步驟

研究人員發(fā)現(xiàn)Cr-RNA與tracrRNA形成的雙鏈RNA（guide RNA，gRNA）介導(dǎo)的雙鏈DNA剪切系統(tǒng)的核心，人為的改造這一雙鏈RNA可以了解細(xì)菌Cas9對(duì)不同物種的DNA系列進(jìn)行任意的切割，gRNA介導(dǎo)Cas9對(duì)靶基因進(jìn)行切割并形成DSB是實(shí)現(xiàn)基因修飾的基礎(chǔ)。Hwang等［7]利用人工合成的sgRNA指導(dǎo)了細(xì)菌蛋白Cas9對(duì)斑馬魚胚胎基因進(jìn)行了修飾，其效率類似于ZFN和TALEN技術(shù)。Cas9/gRNA系統(tǒng)體外構(gòu)建的一般步驟（圖3）：（1）從已知的序列中通過PAM進(jìn)行定位尋找合適的靶位點(diǎn)并合成gRNA，在設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)應(yīng)盡量靠近第一外顯子附近，這樣能夠獲得較高活性的gRNA；（2）將合成好的gRNA與Cas9序列構(gòu)建重組質(zhì)粒。目前在構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中有兩種主要方案：一是將gRNA與Cas9連入同一個(gè)質(zhì)粒載體中并以雙啟動(dòng)子啟動(dòng)，載體中攜帶熒光報(bào)告基因（用于流式細(xì)胞儀篩選）或抗性基因（用于藥物篩選）。二是將gRNA與Cas9分別連載不同的載體上，兩個(gè)載體攜帶有不同的熒光報(bào)告基因或抗性基因；（3）對(duì)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行活性檢測，即敲除活性的計(jì)算；（4）挑選活性較高的敲除質(zhì)粒或者質(zhì)粒對(duì)通過轉(zhuǎn)染或者顯微注射的方法導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞或者生物體內(nèi)進(jìn)行基因組定點(diǎn)編輯操作；（5）利用測序、RFLP等方法檢測基因組定點(diǎn)修飾的結(jié)果。與ZFN、TALEN不同的是，Cas9系統(tǒng)的gRNA的設(shè)計(jì)比較簡單，而第3步的活性檢測則關(guān)系到后期基因的敲除效率，為Cas9系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)過程中的關(guān)鍵一步。

圖3 Cas9/gRNA系統(tǒng)體外構(gòu)建步驟流程圖

2.1 gRNA的設(shè)計(jì)

sgRNA是體外人工合成的一小段單鏈核糖核苷酸，約19-23 bp，其中PAM和5'端的8-12 bp的seed seqence 對(duì)靶向切割雙鏈DNA最為重要。PAM的存在形式主要為NGG，其中N為5'端，PAM的主要作用是對(duì)目標(biāo)DNA序列中的原間隔序列進(jìn)行定位，使sgRNA能夠與靶位點(diǎn)進(jìn)行特異性結(jié)合并介導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別并在其5'端實(shí)現(xiàn)切割。除了PAM和seed seqence之外的5'端的其他堿基序列在對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別時(shí)容易脫靶，這也是Cas9在試驗(yàn)過程中出現(xiàn)脫靶效應(yīng)的原因；在試驗(yàn)過程中為方便后期突變位點(diǎn)的檢測，選擇PAM 5'端存在酶切位點(diǎn)的原間隔序列作為gRNA，可以通過酶切鑒定基因修飾的結(jié)果；研究還發(fā)現(xiàn)在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)，如果DSB的側(cè)翼存在重復(fù)序列，在進(jìn)行非同源末端重組時(shí)能夠精確的介導(dǎo)斷裂位點(diǎn)堿基的缺失。

綜上，sgRNA的設(shè)計(jì)原則有以下幾點(diǎn)：（1）選擇PAM（NGG）5'端的一段堿基序列作為原間隔序列，即敲除的靶位點(diǎn)。（2）選擇的序列必須在全基因組中進(jìn)行比對(duì)，原間隔序列必須唯一，否則會(huì)對(duì)其他基因進(jìn)行敲除而出現(xiàn)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）優(yōu)先選擇DSB位點(diǎn)的側(cè)翼存在重復(fù)序列；（4）PAM的5'端盡量存在酶切位點(diǎn)。

2.2 gRNA的活性檢測

對(duì)設(shè)計(jì)好的sgRNA進(jìn)行活性檢測以獲得突變效率較高的sgRNA用于后期的實(shí)驗(yàn)。目前主要采用的方法有限制性內(nèi)切酶法、非配對(duì)內(nèi)切酶法和SSA活性檢測。

2.2.1 限制性內(nèi)切酶法 生物體內(nèi)存在著一些內(nèi)切酶類，它們能夠特異性的識(shí)別DNA雙鏈中的特定序列并對(duì)其進(jìn)行切割，這些酶能夠降解外源的DNA使之失活卻對(duì)本身固有的DNA沒有影響，所以稱之為限制性內(nèi)切酶。根據(jù)限制性內(nèi)切酶的這種特性，設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)應(yīng)選擇在PAM的5'端存在酶切位點(diǎn)的原間隔序列（特異性的靶位點(diǎn)）。在Cas9/sgRNA靶點(diǎn)位置中間序列中有限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，如HindIII，如果通過Cas9/sgRNA發(fā)生突變，這個(gè)位點(diǎn)將可能被破壞，而不能被HindIII酶切；同時(shí)野生型的細(xì)胞則可被HindIII酶切。可采用電泳的方法估計(jì)突變效率，以突變效率的高低來衡量sgRNA的活性。Wang［8]等在設(shè)計(jì)針對(duì)Tet1、Tet2和Tet3這3個(gè)基因的sgRNA時(shí)分別引入ScaI、EcoR V和XhoI酶切位點(diǎn)，利用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)轉(zhuǎn)染了Cas9/sgRNA細(xì)胞的DNA進(jìn)行酶切后，其突變效率分別為36%、48%和36%。

2.2.2 非配對(duì)內(nèi)切酶法 T7 核酸內(nèi)切酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能夠識(shí)別不完全配對(duì)DNA并對(duì)其進(jìn)行切割，還能對(duì)十字型結(jié)構(gòu) DNA、Holliday結(jié)構(gòu)或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 進(jìn)行識(shí)別和切割，該酶切割錯(cuò)配堿基 5'端的第1、第2或第3個(gè)磷酸二酯鍵。如果通過Cas9/sgRNA發(fā)生突變，將基因組DNA做PCR，將相對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物與野生型DNA的PCR產(chǎn)物等量混合，并退火雜交，將產(chǎn)生非配對(duì)DNA片段，將能被非配對(duì)內(nèi)切酶T7E1剪切。若沒有發(fā)生突變，將產(chǎn)生配對(duì)DNA片段，而無法被非配對(duì)內(nèi)切酶T7E1剪切。用電泳的方法估計(jì)突變效率，以突變效率的高低來衡量sgRNA的活性。Chang等［9]利用此法估算Cas9/sgRNA和TALEN技術(shù)處理的突變效率，結(jié)果表明Cas9/ sgRNA的突變效率比TALEN技術(shù)的突變效率要高10%-15%。

2.2.3 SSA活性檢測 SSA活性檢測原理如圖4所示：一個(gè)終止子插入luciferase（GFP）的編碼區(qū)中央（紅色標(biāo)記），luciferase（GFP）就會(huì)失去活性。為檢測Cas9/sgRNA剪切活性，將一個(gè)Cas9/sgRNA的靶點(diǎn)位置序列插在終止子后（藍(lán)色標(biāo)記）。在Cas9/ sgRNA的作用下，靶點(diǎn)位置產(chǎn)生DSB，細(xì)胞通過同源重組方式修復(fù)DNA，形成一個(gè)有活性的luciferase。通過與對(duì)照組的比值變化就可反應(yīng)Cas9/sgRNA剪切的活性水平。Chang［9]在對(duì)斑馬魚胚胎基因組進(jìn)行修飾時(shí)以GFP為報(bào)告基因進(jìn)行了SSA活性檢測，結(jié)果顯示Cas9/sgRNA處理組的熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的9倍。

圖4 SSA活性檢測原理示意圖（顏色標(biāo)識(shí)見電子版）

3 Cas9/sgRNA系統(tǒng)的應(yīng)用

雖然CRISPR/Cas的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，但是這種技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展卻是近兩年才開始的，目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的細(xì)胞水平或者個(gè)體水平的基礎(chǔ)研究，也已經(jīng)在HEK293細(xì)胞、iPS等細(xì)胞中產(chǎn)生了穩(wěn)定的敲除細(xì)胞株。另外，科研人員利用顯微注射等方法獲得小鼠、大鼠和斑馬魚等模式動(dòng)物的敲除個(gè)體并順利產(chǎn)生后代。

3.1 Cas9/sgRNA系統(tǒng)細(xì)胞水平進(jìn)行基因的修飾

目前，科研人員已經(jīng)利用產(chǎn)鏈膿桿菌的typeII型系統(tǒng)改造的Cas9系統(tǒng)在人類細(xì)胞，小鼠及斑馬魚等物種中完成基因修飾并取得良好結(jié)果。

Jinek［10]課題組以人類細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行基因的靶向修飾，試驗(yàn)中篩選的細(xì)胞順利產(chǎn)生DSB，說明Cas9系統(tǒng)可用于人類細(xì)胞。他們對(duì)Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了改造，改造過程中發(fā)現(xiàn)TracrRNA是Cas9系統(tǒng)具有活性必不可少的組分，作者還詳細(xì)闡述了Cas9系統(tǒng)的切割原理以及切割的具體位置；試驗(yàn)還表明gRNA的表達(dá)對(duì)Cas9的活性是必不可少的，而且gRNA的3'端的適當(dāng)延伸能夠顯著增加Cas9系統(tǒng)的活性。Jinek等的試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)的Cas9系統(tǒng)的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為基因靶向修飾提供了一個(gè)除ZFN和TALEN之外的另一個(gè)寶貴的實(shí)驗(yàn)工具，這為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)尤其是基因治療提供了新思路、新方法、新途徑。

隨后研究人員對(duì)Cas9系統(tǒng)中不同組分對(duì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響進(jìn)行了探索。Cho［11]團(tuán)隊(duì)以人的細(xì)胞為試驗(yàn)材料，通過試驗(yàn)證明在共轉(zhuǎn)染體系中g(shù)RNA的濃度的增加能夠提高基因的敲除效率，最高效率達(dá)到33%。Mail等［12]改造了Cas9系統(tǒng)以用于人類基因組編輯，并順利地在HEK 293和K652細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因的靶向敲除。Cong等［13]利用Cas9系統(tǒng)在小鼠的nero2A細(xì)胞中的Th基因以及HEK293細(xì)胞的EMX1基因，PVALB基因?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)敲除。Cong和mali通過試驗(yàn)表明gRNA在結(jié)構(gòu)上越接近c(diǎn)rRNA和tracrRNA復(fù)合體，則在試驗(yàn)過程中能夠獲得較高的敲除效率。

目前利用Cas9進(jìn)行基因敲除的技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，利用此技術(shù)在細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)單基因或者多基因的敲除。Mali等［12]利用此技術(shù)在人的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因的敲除，靶向敲除效率分別為HEK 293為10%-25%，K562為8%-13%，iPS為2%-49%；Wang等［8]通過共轉(zhuǎn)染的方法在小鼠的胚胎干細(xì)胞中對(duì)Tet1、Tet2、Tet3、Uty和Sry等基因中實(shí)現(xiàn)了單基因、雙基因及多基因的敲除，敲除效率達(dá)40%左右，并通過測序、RFLP及DNA印跡等方法進(jìn)行了驗(yàn)證。Cong等［13]也在人和小鼠的細(xì)胞中也實(shí)現(xiàn)了多基因的同時(shí)敲除。利用多基因敲除試驗(yàn)的成功將有利于科研人員在體內(nèi)研究冗余基因以及上位基因的功能。

3.2 Cas9/sgRNA系統(tǒng)個(gè)體水平進(jìn)行基因的修飾

自20世紀(jì)80年代第一只基因敲除小鼠的產(chǎn)生，科研工作者一直致力于基因敲除模型的制備，期間雖然ZFN和TALEN也曾一時(shí)興起，然而這兩種方法耗時(shí)耗力，過程也很繁瑣。Cas9系統(tǒng)的產(chǎn)生為基因敲除模型的制備提供了新方法。

Friedland等［14]以線蟲為生物模型，通過顯微注射的方法向線蟲胚胎細(xì)胞中注射Cas9/gRNA質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)基因在個(gè)體水平上的基因敲除，敲除效率約為88%，為保證這種方法的順利使用，作者還介紹了一種新的檢測基因突變的方法——高分辨率融化分析（High-resolution melt analysis）。Hwang 等［7]利用Cas9/ gRNA通過對(duì)斑馬魚胚胎 drd3、gsk3b基因進(jìn)行修飾，獲得了這兩個(gè)基因位點(diǎn)的突變的突變體；Li等［15]利用Cas9系統(tǒng)在小鼠的個(gè)體上實(shí)現(xiàn)了基因的靶向修飾，通過顯微注射的方法將Cas9以及gRNA的mRNA共注射進(jìn)小鼠的胚胎干細(xì)胞對(duì)Uhrf2基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，獲得了Mc3R、Mc4cRL兩只雙基因敲除小鼠。Wang等［8]通過顯微共注射mRNA的方法獲得了Tet1、Tet2的單基因敲除小鼠以及雙基因敲除小鼠，并在其后代中仍然為敲除陽性。利用Cas9技術(shù)產(chǎn)生基因敲除模型能夠很好的應(yīng)用于基因治療以及家畜育種過程中。

4 存在的問題

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要以及gRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出符合實(shí)驗(yàn)需求且特異性較高的gRNA，并能在活性檢測過程中具有較高的活性（即較高的敲除效率）為試驗(yàn)難點(diǎn)之一。

避免試驗(yàn)過程中Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)。雖然Wang［8]對(duì)Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明無脫靶效應(yīng)，但是由于物種之間存在差異以及所設(shè)計(jì)的gRNA之間有差別，因此Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)有待于進(jìn)一步研究。

Cas9系統(tǒng)在高度分化的細(xì)胞、細(xì)胞系以及個(gè)體上都有較為理想的試驗(yàn)結(jié)果，但是在未建系的干細(xì)胞上尚未有成功的先例，尤其是在轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA質(zhì)粒或者mRNA后如何篩選出陽性克隆進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)這一問題有待解決。

Cas9系統(tǒng)的毒性問題。Cas9為細(xì)菌蛋白，目前尚不清楚其在其他物種的細(xì)胞中作用是否會(huì)產(chǎn)生毒性。Wang等在他們的試驗(yàn)中對(duì)Cas9的用量進(jìn)行了梯度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)提高Cas9的濃度有利于提高基因的敲除效率，但是200 ng的濃度不能證明對(duì)其他物種也適用。因此Cas9系統(tǒng)的毒性問題有待于進(jìn)一步解決。

5 展望

II型CRISP/Cas應(yīng)用為一種新型的基因靶向修飾技術(shù)，雖然這種應(yīng)用尚處于起步階段，但是相比于ZFN、TALEN技術(shù)的耗時(shí)、耗力以及設(shè)計(jì)繁瑣等缺點(diǎn)而言Cas9以其設(shè)計(jì)簡單，耗時(shí)短，實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)等優(yōu)勢而被科研人員廣泛使用。一般而言，以小鼠為試驗(yàn)材料，Cas9系統(tǒng)最快可在6-8周內(nèi)產(chǎn)生基因敲除模型，這就大大的節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間而且成功率高。ZFN和TALEN以FoxI酶為核心，而Cas9系統(tǒng)則以Cas9酶為核心，在修飾過程中Cas9系統(tǒng)在gRNA的介導(dǎo)下的特異性比ZFN、TALEN更強(qiáng)，能夠更加準(zhǔn)確的對(duì)基因進(jìn)行修飾；當(dāng)需要針對(duì)基因組中不同的切割位點(diǎn)時(shí)，ZFN、TALEN需要重新設(shè)計(jì)，而Cas9/gRNA系統(tǒng)只要重新合成gRNA即可。這些是ZFN、TALEN技術(shù)所達(dá)不到的。

雖然目前II型CRISP/Cas的研究尚屬嶄新領(lǐng)域，但是此技術(shù)將成為基因工程研究的一種新工具，雖然關(guān)于CRISP/Cas的系統(tǒng)具體機(jī)制不甚了解，部分問題有待于進(jìn)一步解決，但是我們相信隨著科研人員對(duì)CRISP/Cas系統(tǒng)研究的不斷深入，CRISP/Cas系統(tǒng)將更好的幫助科研人員了解基因的功能，探索基因組的奧秘。

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