解脂耶氏酵母誘變育種及發酵產α-酮戊二酸條件優化

鞏健

（1. 淄博職業學院制藥與生物工程系，淄博 255314；2. 山東省曲霉應用工程技術研究中心，淄博 255314）

α-酮戊二酸是一種重要的有機酸，在代謝中起著重要的作用，是三羧酸循環的重要中間產物之一，也是合成多種氨基酸、蛋白質的前體物質［1]。作為營養強化劑，能有效降低術后患者和病人的機體損耗，在腦部可以作為酪氨酸和谷氨酸的前體，且能夠用于治療黃褐斑，清除自由基、延緩衰老［2]，在醫藥［3]、食品［4]、化工和化妝品行業有廣泛的應用。隨著對α-酮戊二酸應用價值的研究加深，市場對于其需求量在不斷增大。但是由于傳統的化學法合成α-酮戊二酸過程復雜，且在原料來源和生產過程中存在嚴重的安全問題，無法直接用于食品和藥品中［5]。因此，微生物發酵法生產α-酮戊二酸逐漸成為新的研究方向。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有過量合成α-酮戊二酸的能力，并被美國食品藥品管理局認為是安全的生產微生物，因此逐漸成為國內外發酵法生產α-酮戊二酸的研究熱點［6]。尤其是近年來，江南大學的陳堅教授及其研究團隊在發酵產α-酮戊二酸的研究取得了重大的突破。2010年，在煉油廠附近的土壤中篩選出一株硫胺素營養缺陷型的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06，保藏編號CCTCC NO：M207143，該菌株在以甘油為碳源發酵條件下能夠產生39.2 g/L的α-酮戊二酸［7]。隨后，通過采用在該菌株內過量表達丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase）的方法，改變碳代謝流，降低了副產物丙酮酸，同時提高了α-酮戊二酸的產量［8]。另外，又通過發酵條件的控制優化，補加甘油和碳酸鈣，實現了66.2 g/L的α-酮戊二酸高產量［9]。

獲得具有優良生產性能的菌種，是發酵工業的核心資源。而誘變育種是進行菌種選育的重要方法，發酵工業中正在使用的絕大部分高產優良菌株都是采用誘變育種得到的。然而到目前為止，對于具有發酵產α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）誘變育種工作仍未見報道。因此，本研究以實驗室的一株解脂耶氏酵母ZY-4作為出發菌株，通過紫外線誘變和NTG化學誘變方法，篩選得到α-酮戊二酸產量提高的突變株，并對突變株的發酵培養基成分進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養基 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）硫胺素營養缺陷型菌株ZY-4，本實驗室保存。

種子培養基：酵母膏 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，若制固體培養基，加入20 g/L瓊脂粉。

初篩培養基：葡萄糖 20 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水硫酸鎂 0.5 g/L，氯化銨 3.0 g/L，青霉素 0.05 g/L，制霉菌素 0.08 g/L， 硫胺素 10 μg/L，溴甲酚綠 1.0 g/L，瓊脂 20 g/L。

發酵培養基：葡萄糖 100 g/L，磷酸二氫鉀 1.0 g/L，七水硫酸鎂 0.5 g/L，氯化銨 3.0 g/L，硫胺素5.0 μg/L。

1.1.2 儀器與設備 BS-1E型振蕩培養箱，SWCJ-2D型超凈工作臺，TU-I901型紫外可見分光光度計，LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，HC-3018R型高速冷凍離心機，SHIMADZU LC-2010AHT型高效液相色譜。

1.2 方法

1.2.1 紫外線誘變處理 挑取一環保藏的Yarrowia lipolyticaZY-4接種至種子培養基，在30℃ 條件下200 r/min的恒溫搖床上培養48 h，進行種子的活化。再以5%的接種量轉接后，每隔2 h測定菌液OD600值。取對數生長期菌液，4 500 r/min離心10 min收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，取5 mL菌懸液（105CFU/mL）加入直徑9 cm的無菌培養皿中，開啟15 W紫外燈預熱30 min后距離30 cm進行紫外照射，照射時間分別為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s。在紅燈下，取照射后的菌液，用生理鹽水梯度稀釋后涂布種子培養基固體平板，同時以未照射的菌液為對照，置30℃避光培養48 h后，計算致死率。1.2.2 NTG誘變處理 將經過紫外誘變篩選出的突變株培養到對數期，收集菌體并用pH6.0磷酸緩沖液洗滌兩次，取一定量的菌懸液（105CFU/mL），加入亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8以及1.0 mg/mL，30℃下振蕩培養20 min后，4 500 r/min離心10 min終止反應，用pH6.0磷酸緩沖液洗滌3次并制成合適的稀釋度涂布種子培養基固體平板，30℃恒溫培養48 h后，計算致死率。

1.2.3 突變菌株篩選 初篩：誘變后的菌液經適當稀釋后，涂布于初篩培養基固體平板，30℃恒溫培養后，產α-酮戊二酸菌落周圍形成黃色變色圈，挑選生長旺盛、產酸快且變色圈與菌落直徑之比較大者作為初篩菌株。

復篩：挑取初篩產量較高的菌落，轉接至發酵培養基，30℃條件下200 r/min搖床恒溫培養3-5 d，每個菌落做3次平行，用HPLC測定發酵液中的α-酮戊二酸含量。

1.2.4 發酵培養基優化 碳源優化：將篩選到的突變株培養到對數生長中期，以5%的接種量分別接種至含有不同濃度葡萄糖（100、130、160及200 g/L）和甘油（2%、5%、8%、10%）為碳源的搖瓶，搖瓶中其他培養基成分與發酵培養基相同。

氮源濃度優化：以甘油濃度8%為碳源，氯化銨濃度分別為（1.0、3.0、5.0、7.0 及10 g/L），其他成分與發酵培養基相同。

硫胺素濃度優化：以甘油濃度8%為碳源，5.0 g/L氯化銨為氮源，硫胺素濃度分別為（1.0、3.0、5.0、7.0及9.0 μg/L），其他成分與發酵培養基相同。

發酵條件：30℃條件下200 r/min搖床恒溫培養3-5 d，期間根據pH變化流加CaCO3。

1.2.5 分析方法 將待測發酵液于10 000 r/min條件下離心5 min后，取上清液進行分析檢測。葡萄糖的測定使用3，5-二硝基水楊酸法［10]。甘油的測定使用改進的滴定法［11]。α-酮戊二酸的測定采用高效液相色譜法（HPLC）［12]。

2 結果

2.1 紫外線誘變

2.1.1 誘變時間的確定 將解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4分別紫外線照射10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s后，30℃避光培養48 h計算致死率，結果如圖1所示。

圖1 解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ZY-4紫外線誘變致死率

由圖1可知，紫外線對解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4的致死效果在前20 s內不明顯，20 s時僅達到 37.79%。30 s后致死率隨照射時間的延長而顯著增加，在50 s時達到91.29%，在60 s和70 s時紫外線的致死率分別為96.28% 和99.06%，致死效果十分明顯。本試驗紫外線對解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4菌懸液照射40 s時致死率為76.38%，易于發生提高產量的正向突變，因此，紫外線誘變的照射時間確定為40 s。

2.1.2 突變菌株篩選 紫外誘變菌株初篩：解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4菌懸液經過紫外照射40 s后，稀釋并涂布于初篩平板培養，經過觀察挑選出7株生長較快且變色圈與菌落直徑之比較大的突變菌株，進行復篩試驗。

紫外誘變菌株復篩：對初篩得到的7株突變株分別進行搖瓶發酵試驗，通過HPLC測定發酵液中α-酮戊二酸產量，結果見表1。由表1可知，突變株7號的α-酮戊二酸產量較高，達到了18.1g/L，比原始出發菌株產量提高了67.8%。

表1 紫外誘變菌株搖瓶發酵α-酮戊二酸產量

2.2 NTG誘變

2.2.1 誘變劑量的確定 為了進一步提高菌株的α-酮戊二酸產量，同時減少單一誘變劑產生的疲勞效應，對經過紫外誘變選育得到的突變株7號又進行了NTG誘變。加入亞硝基胍濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mg/mL，30℃條件下誘變20 min，去除誘變劑并培養48 h后計算致死率，結果如圖2所示。

圖2 解脂耶氏酵母ZY-4紫外線誘變突變株7號經亞硝基胍誘變致死率

由圖2可知，在亞硝基胍誘變過程中，隨著誘變劑量的增大，解脂耶氏酵母的死亡率明顯提高，NTG濃度為0.4 mg/mL時就達到67.48%，誘變劑量為1.0 mg/mL時致死率達到了93.77%。為了提高篩選效率，本研究采用1.0 mg/mL作為誘變劑NTG的最終濃度。

2.2.2 突變菌株篩選 NTG誘變菌株初篩：經過紫外誘變后的突變株7號菌懸液使用濃度為1.0 mg/mL的NTG處理20 min，去除誘變劑后，稀釋并涂布于初篩平板培養，經過觀察挑選出4株變色圈與菌落直徑之比較大的突變菌株，進行復篩試驗。

NTG誘變菌株復篩：對初篩得到的4株突變株分別進行搖瓶發酵試驗，通過HPLC測定發酵液中α-酮戊二酸產量，結果見表2。由表2可知，經過亞硝基胍誘變育種后得到的4株突變株α-酮戊二酸產量均有提高，其中突 變株2號的α-酮戊二酸產量較高，達到了22.7g/L，比經過紫外誘變得到的7號突變株產量提高了25.4%，比原始出發菌株ZY-4產量提高了110%。將經過亞硝基胍誘變育種后得到的2號菌株，命名為解脂耶氏酵母YB-2。

表2 NTG誘變菌株搖瓶發酵α-酮戊二酸產量

2.3 發酵培養基優化

2.3.1 碳源優化結果 分別以不同濃度葡萄糖（100、130、160以及200 g/L）和甘油（2%、5%、8%、10%）為碳源進行搖瓶發酵，比較不同碳源對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產量影響，結果如圖3所示。

圖3 碳源對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產量影響

由圖3可知，不同濃度的葡萄糖和甘油作為碳源對解脂耶氏酵母的α-酮戊二酸產量均有影響。其中，以葡萄糖作為碳源時，葡萄糖濃度的增大對發酵液中α-酮戊二酸的積累影響較小。培養基中葡萄糖濃度由100 g/L增大一倍至200 g/L時，α-酮戊二酸的產量僅由22.6 g/L提高至28.4 g/L，提高了25.7%。相比之下使用甘油作為碳源，發酵液中積累的α-酮戊二酸隨著甘油濃度的增大變化明顯。當甘油濃度為2%時，α-酮戊二酸產量為11.9 g/L。甘油濃度增大至5%和8%時，α-酮戊二酸產量分別達到22.4 g/L和30.6 g/L。繼續增大甘油濃度至10%，雖然α-酮戊二酸產量提高到32.3 g/L，但解脂耶氏酵母生長較慢，發酵周期延長。因此，本試驗最終確定使用8%濃度的甘油作為培養基碳源。

2.3.2 氮源優化結果 α-酮戊二酸位于細胞碳—氮代謝的關鍵節點，培養基中氮源濃度會對α-酮戊二酸的積累產生影響。以8%濃度的甘油作為碳源，分別以不同濃度氯化銨（1.0、3.0、5.0、7.0 及10 g/L）為氮源進行搖瓶發酵，得到的α-酮戊二酸產量結果如圖4所示。

圖4 氮源氯化銨濃度對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產量影響

由圖4可知，培養基中過低（1.0 g/L）或過高（10 g/L）的NH4Cl均不利于α-酮戊二酸的積累，氮源的添加最佳濃度為5.0 g/L。當低于5.0 g/L時，α-酮戊二酸濃度隨培養基中NH4Cl濃度的增加而不斷增加，當NH4Cl濃度為5.0 g/L時，α-酮戊二酸濃度達到最大值（32.9 g/L）。但繼續增加NH4Cl濃度并不能繼續提高產生的α-酮戊二酸濃度，當NH4Cl濃度高于5.0 g/L時，產生的α-酮戊二酸反而減少。

2.3.3 硫胺素優化結果 由于解脂耶氏酵母突變株YB-2仍然是硫胺素營 養缺陷型，硫胺素作為限制性因素對α-酮戊二酸的積累有較大影響。以8%濃度的甘油作為碳源，5.0 g/L NH4Cl為氮源，比較不同硫胺素濃度（1.0、3.0、5.0、7.0及9.0 μg/L）條件下α-酮戊二酸產量影響，結果如圖5所示。

圖5 硫胺素濃度對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產量影響

由圖5可知，硫胺素濃度為1.0 μg/L時最有利于α-酮戊二酸的積累。隨著硫胺素濃度的增加，α-酮戊二酸的積累量逐漸減少。硫胺素濃度為1.0 μg/L時，能夠積累35.9 g/L的α-酮戊二酸，而當培養基中添加的硫胺素濃度達到9.0 μg/L時，產生的α-酮戊二酸為30.5 g/L，僅是添加1.0 μg/L硫胺素時的85%。

3 討論

多年來，大量的研究者從許多方面對微生物發酵法生產α-酮戊二酸進行了探索，例如，優化培養基成分、優化發酵條件、控制輔因子濃度，或者通過分子生物學方法過量表達參與代謝的酶等方法，嘗試提高發酵法合成α-酮戊二酸的產量［5]。這些方法從根本上來說分為兩類，一類是優化發酵條件，另一類是選育具有更好生產性能的微生物菌種。菌種選育的方法主要是自然選育、誘變選育、原生質體融合以及基因工程育種等方法。本研究采用了紫外線以及亞硝基胍誘變選育的方法，獲得了α-酮戊二酸的產量提高的解脂耶氏酵母YB-2，這是目前首次成功對產α-酮戊二酸的解脂耶氏酵母進行誘變育種的報道。

本研究進而對突變株YB-2的發酵培養基進行了初步優化。使用甘油為碳源能夠得到比使用葡萄糖為碳源更高的α-酮戊二酸產量，最佳碳源確定為8%濃度的甘油，繼續提高甘油濃度會使得突變株YB-2生長速度減慢，積累α-酮戊二酸的時間延后。氮源NH4Cl濃度為5.0 g/L時最有利于α-酮戊二酸的的積累，這可能是由于當NH4Cl濃度較低時，氮源成為解脂耶氏酵母生長代謝的限制性因素，此時增加氮源可以提高α-酮戊二酸的產量。但當NH4Cl濃度較高時，過量的NH4+被用來進行氨基酸合成，因此TCA循環中間代謝產物α-酮戊二酸被用來進行谷氨酸合成代謝，從而降低了α-酮戊二酸的產量。較低的硫胺素濃度有利于α-酮戊二酸的積累，由于培養基中硫胺素濃度較低時，以硫胺素為輔因子的α-酮戊二酸脫氫酶KGDH和丙酮酸脫氫酶PDH活力大幅下降［1]，甘油經過代謝后只能被氧化為丙酮酸和α-酮戊二酸，從而實現積累。

4 結論

（1）對解脂耶氏酵母進行了紫外誘變選育，篩選到α-酮戊二酸產量提高的正突變株，達到了18.1 g/L，比原始出發菌株ZY-4產量提高了67.8%。

（2）對紫外誘變獲得的突變株又進行了亞硝基胍誘變育種，并篩選到產量繼續提高的突變株YB-2，α-酮戊二酸產量達到了22.7 g/L，比原始出發菌株ZY-4產量提高了110%。

（3）優化了突變株YB-2的培養基成分，優化后的培養基碳源使用8%的甘油，5.0 g/L NH4Cl為氮源，硫胺素濃度為1.0 μg/L，上述條件最有利于α-酮戊二酸的積累，優化后α-酮戊二酸比原始出發菌株ZY-4產量提高了232.4%。

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