一株生物表面活性劑產生菌的分離及產劑性能研究

王睿 吳涓

（安徽大學資源與環(huán)境工程學院，合肥 230601）

生物表面活性劑（Biosurfactants，簡稱BS）是由酶或微生物等通過生物催化和生物合成等生物技術，由植物、動物或微生物產生的集親水基和憎水基于一體的具有表面活性的代謝產物［1]。生物表面活性劑包括糖脂類、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂類、高分子聚合物及微粒生物表面活性劑等不同種類。與化學合成表面活性劑相比，生物表面活性劑除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和發(fā)泡功能外，還具有良好的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性；乳化和破乳能力強；無毒、用量少；與生態(tài)環(huán)境相容，能被微生物完全降解等優(yōu)良性能。因此，生物表面活性劑在石油工業(yè)和環(huán)境工程中展示出獨特的應用前景［2]。劉五星等［3]分離得到一株醋酸鈣不動桿菌，該菌具有較強的乳化柴油的能力。有研究表明，用產生物表面活性劑菌株的菌液直接進行石油污泥洗脫處理，取得了很好的除油效果［4，5]。

目前國外主要在開發(fā)各類新型生物表面活性劑、尋找最適合成條件，表面活性劑結構的剖析與改性，以及室內驅油物理模擬等方面展開研究［6]。而國內研究起步較晚，重點則主要集中在生物表面活性劑產生菌的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化等方面。張秋卓等［7]研究了銅綠假單胞菌產鼠李糖脂的適宜條件。張翠竹等［8]研究了地衣芽飽桿菌（Bacillus licheniformis）產脂肽類生物表面活性劑的最適條件。

研究生物表面活性劑產生菌的生長規(guī)律，探討生物表面活性劑的特性及作用機理，對微生物采油技術的改進和完善以及原油的驅油降黏具有十分重要的理論和實際意義［9]。而目前國內外篩選出的生物表面活性劑產生菌種類還不是十分豐富，且高效菌比較少。本研究采用藍色凝膠平板篩選法從某油田受污染的土樣中分離出一株具有較強產生物表面活性劑能力的菌株，并對其進行分子生物學鑒定；同時對該菌株合成生物表面活性劑的條件進行優(yōu)化，旨為今后的工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 華北某油田受污染的土樣。

1.1.2 富集培養(yǎng)基（g/L） （NH4）2SO45.0，葡萄糖2.0，KCl 1.1，NaCl 1.1，FeSO40.028，KH2PO41.5，K2HPO41.5，MgSO40.5，酵母粉0.5。微量元素溶液5 mL，液體石蠟0.5 mL，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 藍色凝膠培養(yǎng)基（g/L） 牛肉膏1.0，葡萄糖20.0，蛋白胨5.0，酵母粉0.2，C16H33N（CH3）3Br 0.2，C16H18ClN3S 0.005，瓊脂20。蒸餾水1 000 mL。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖2.0，（NH4）2SO45.0，KCl 1.1，NaCl 1.1，FeSO40.028，KH2PO41.5，K2HPO41.5，MgSO40.5，酵母粉0.5。液體石蠟0.5 mL，微量元素溶液5 mL。

1.2 生物表面活性劑產生菌的篩選與鑒定

1.2.1 篩選 稱取樣品10 g，加入90 mL 無菌水，150 r/min搖床振蕩1 h，靜置30 min后取上清液10 mL接種到100 mL已滅菌的富集培養(yǎng)集中，于35℃、150 r/min 的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)3 d。在同樣條件下進行二次培養(yǎng)。取二次富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液1 mL，用無菌水進行梯度稀釋，取不同濃度梯度的富集培養(yǎng)液，均勻涂布在藍色凝膠培養(yǎng)基上，于35℃下恒溫培養(yǎng)3 d。挑選藍色凝膠平板上藍色暈圈較大的菌落，進一步純化，得到初篩菌株［10-12]。將初篩菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)3 d。測定發(fā)酵液的表面張力，篩選出產生物表面活性劑的優(yōu)勢菌種。

1.2.2 表面張力的測定方法 將發(fā)酵液過濾除油，12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用JZHY 1-180型界面張力儀測定其表面張力。

1.2.3 菌株的生理生化性質測定 參照《簡明第八版伯杰細菌鑒定手冊》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株H1進行生理生化性質的測定。采用 DNA 快速提取試劑盒提取降解菌的DNA，對提取的DNA進行16S rDNA的PCR 擴增，引物為通用引物：正向引物F27（+）5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物 R1492（-）5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。將PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳后，由上海生物工程技術服務有限公司進行 16S rRNA測序，將所測序列在GenBank核酸序列數據庫中與已有的其他 16S rRNA 序列數據進行同源性分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 在發(fā)酵液表面張力為指標，以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別考察碳氮源種類、碳氮源濃度、初始pH值及溫度對生物表面活性劑合成的影響。

2 結果

2.1 生物表面活性劑產生菌的篩選鑒定

從華北某油田受污染的土樣中分離得到1株產生物表面活性劑的能力較強的菌株H1。由圖1可見，有藍色暈圈的單菌落即為目標菌株，其菌落特征是：扁平、圓形、表面光滑。該菌株為革蘭氏陽性菌。該菌株的生理生化特征，見表1。

圖1 菌落形態(tài)

表1 菌株H1的生理生化特性

經PCR擴增后，菌株H1的16S rDNA片段長約1 440 bp，經BLAST比對后發(fā)現該菌株與Klebsiella pneumoniae同源性為99%。使用MEGA5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖2所示。結合形態(tài)學特征、生理生化特征和BLAST不比對分析，菌株H1可鑒定為肺炎克雷伯氏菌。

圖2 菌株H1的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 產劑性能研究

2.2.1 碳源對生物表面活性劑合成的影響 碳源提供細胞生長繁殖所需要的能量，為細胞和代謝產物提供物質基礎。試驗以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉、正十二烷為碳源，在30℃，150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)，分別測定培養(yǎng)液的OD值和表面張力。由圖3可見，當碳源為水溶性碳源時，細胞生長良好，除蔗糖外，其他幾種碳源對細胞的生長及發(fā)酵液表面張力的影響大體相同。而采用正十二烷為碳源時，OD值很低，且培養(yǎng)液表面張力也很大。而以蔗糖為碳源時，細胞生長良好，且培養(yǎng)液的表面張力最小，應為最適碳源。

圖3 碳源種類對菌株H1培養(yǎng)液表面張力的影響

以蔗糖為唯一碳源，其他條件不變，考察不同蔗糖濃度對菌株H1合成生物表面活性劑的影響。由圖4可見，當蔗糖濃度從0 g/L逐漸增大到4 g/L時，發(fā)酵液的表面張力逐漸降低，且在蔗糖濃度為4 g/L時其表面張力值最低。由此表明，蔗糖濃度過高對生物表面活性劑的合成起到了抑制作用。

圖4 蔗糖濃度對菌株H1培養(yǎng)液表面張力的影響

2.2.2 氮源對生物表面活性劑合成的影響 氮源是細胞生長過程中蛋白質和核酸等生物大分子中氮元素的來源，對微生物的生長發(fā)育和生物表面活性劑的合成起重要作用。試驗以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，以蔗糖為碳源，分別以尿素、硝酸銨、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉為氮源，于30℃，150 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)，分別測定培養(yǎng)液的OD值和表面張力。由圖5可見，采用硝酸銨做氮源時，細胞生長良好，僅次于蛋白胨，培養(yǎng)液的表面張力是最低的，而其他氮源均不利于生物表面活性劑的合成。由此可見，蛋白胨雖然由于營養(yǎng)較為豐富，能促進細胞的生長，但對生物表面活性劑的合成來說它并不是最適氮源，最適氮源為硝酸銨。

圖5 氮源種類對菌株H1培養(yǎng)液表面張力的影響

以硝酸銨為唯一氮源，考察不同硝酸銨濃度對菌株H1合成生物表面活性劑的影響。由圖6可知，當硝酸銨濃度逐漸增大時，發(fā)酵液的表面張力值呈先減小后增大的趨勢，并且在硝酸銨濃度為3 g/L時其表面張力值最低，硝酸銨濃度大于3 g/L時，發(fā)酵液表面張力值值反而增大，因此應將硝酸銨濃度選擇為3 g/L。

2.2.3 pH值對生物表面活性劑合成的影響 微生物在過酸和過堿的條件下生長狀況都不佳。以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，以蔗糖為碳源，以硝酸銨為氮源，將菌株H1接種于不同初始pH值的培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)，所測定的培養(yǎng)液OD值及表面張力值，如圖7所示。不同pH值條件下的培養(yǎng)液的表面張力值不同，當培養(yǎng)液pH值從6.0增大至7.0時，其表面張力值略有下降；當培養(yǎng)液pH值為7.0時，其表面張力值最低；而當pH值大于7.0時，培養(yǎng)液的表面張力值顯著增大，并且細胞的生長也并非最佳狀態(tài)。因此，控制培養(yǎng)基pH值在7.0將有利于生物表面活性劑的合成。

圖6 硝酸銨濃度對生物表面活性劑表面張力的影響

圖7 pH值對菌株H1培養(yǎng)液表面張力的影響

2.2.4 溫度對生物表面活性劑合成的影響 溫度也是影響微生物產表面活性劑的重要影響因素之一，微生物的生長和生物表面活性劑的合成是在各種酶催化下進行的，而溫度是保證酶活的首要條件。以蔗糖為碳源，以硝酸銨為氮源，將菌株H1接種于pH7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)。圖8表明，當溫度從20℃升高到40℃時OD值緩慢下降，其后當溫度升高到50℃時，OD值急劇下降，可見高溫不利于該微生物的生長代謝。而隨著溫度升高，培養(yǎng)液的表面張力值則表現出先減小后增大的趨勢，當溫度為30℃時表面張力值最低，此后表面張力值顯著增大。顯然，30℃的培養(yǎng)溫度有利于生物表面活性劑的合成。

圖8 培養(yǎng)溫度對菌株H1培養(yǎng)液表面張力的影響

3 討論

生物表面活性劑由于其良好的表面活性及環(huán)境良好性，受到廣泛關注。迄今為止，國內外已篩選出一些能夠產生生物表面活性劑的純菌株，但種類不多，目前報道能夠產生生物表面活性劑的菌屬有假單胞菌屬、紅球菌屬和芽孢桿菌屬等。本研究從華北某油田受污染的土樣中篩選到一株產生物表面活性劑的菌株H1，經16S rDNA分析鑒定為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。菌株H1能使培養(yǎng)液表面張力降低60%以上，表明該菌株具有較強的產生物表面活性劑的能力。

在篩選生物表面活性劑產生菌時，通常是采用溶血圈法［13]，但溶血圈不規(guī)則，而且血液成分較復雜，其中一些成分或雜菌也會產生類似的溶血圈，給篩選帶來干擾。本研究在篩選時利用藍色凝膠培養(yǎng)基，微生物合成的表面活性劑能夠在不易染菌的藍色凝膠培養(yǎng)基上產生深藍色暈圈，更容易觀察判斷，也使得篩選結果更具準確性。

目前，生物表面活性劑主要通過微生物發(fā)酵法合成，其種類和產量取決于產生菌的種類和培養(yǎng)條件。雖然生物表面活性劑具有生物可降解性、更強的表/界面活性和熱穩(wěn)定性，但其產量低、成本高，使其推廣應用受到限制。本研究考察了碳氮源種類、碳氮源濃度、初始pH值、溫度等因素對菌株H1生長和合成生物表面活性劑能力的影響，旨在尋求該生物表面活性劑的最適合成條件。碳源為細胞和代謝產物中的碳提供來源，并供給微生物生長發(fā)育所需要的能量；氮源是合成原生質和細胞其它結構的原料，對微生物的生長發(fā)育和穩(wěn)定生長起重要作用［14]。在本試驗中最適碳源為蔗糖，最適氮源為硝酸銨。在所考察的因素中，環(huán)境pH值和培養(yǎng)溫度對生物表面活性劑的合成也非常重要。一般認為初始pH值控制在6.5-8.5范圍內有利于生物表面活性劑的合成［15]。本試驗中合成生物表面活性劑的最適pH值是7.0。高小朋等［16]從受石油污染的土壤中篩選得到1株生物表面活性劑產生菌CT-6，優(yōu)化試驗表明該菌產表面活性劑的最適pH值是8.0。介質pH會影響細胞膜電荷的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質的吸收，進而影響微生物的生長。在過高或過低的pH條件下，微生物生長狀態(tài)不佳，就會影響到表面活性劑的合成，因為表面活性劑是次生代謝產物。培養(yǎng)溫度對于微生物的生長和發(fā)酵產物的合成影響也較大，適宜的溫度不僅有利于細胞的生長，也利于發(fā)酵產物的積累［17]。但不同的菌種產表面活性劑時對溫度的要求不一樣。本試驗所篩菌株產表面活性劑的最適溫度是30℃，而劉暢等［18]從自然腐爛的秸稈中篩選到1株表面活性劑產生菌B-17，該菌產表面活性劑的最適溫度是20℃。

本研究通過對生物表面活性劑產生菌的篩選、鑒定，以及影響生物表面活性劑合成的因素的研究，為生物表面活性劑的合成提供了新的菌源，也為提高生物表面活性劑的合成能力提供了科學依據，從而為新型表面活性劑的開發(fā)和應用奠定了基礎。

4 結論

本研究采用藍色凝膠平板篩選法，從華北某油田受污染的土壤中篩選到一株產生物表面活性劑的菌株H1，經16S rDNA分析鑒定為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。該菌株能使培養(yǎng)液表面張力降低60%以上。同時考察了碳氮源種類、初始pH值、溫度等因素對菌株H1生長和合成生物表面活性劑能力的影響，結果表明，其最適碳源為蔗糖，最適氮源為硝酸銨，且初始pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃對該生物表面活性劑的合成是最有利的。

［1] Youssef NH, Duncan KE, Nagle DP, et al. Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorgaisms［J] .Journal of Microbiological Methods, 2004, 56（3）：339-347.

［2] 趙國文, 張麗萍, 白利濤. 生物表面活性劑及其應用［J] . 日用化學工業(yè), 2010, 40（4）：293-295.

［3] 劉五星, 駱永明, 滕應, 等.石油污染土壤的生態(tài)風險評價和生物修復 I.一株具有乳化石油能力的細菌分離鑒定［J] .土壤學報, 2006, 43（3）：461-466.

［4] 陳忠喜, 郭書海, 劉廣民, 等.除油生物表面活性劑產生菌的分離及其特性［J] .哈爾濱工業(yè)大學學報, 2007, 39（4）：586-588.

［5] 牛明芬, 李鳳梅, 韓曉日, 等. 生物表面活性劑產生菌篩選及表面活性劑穩(wěn)定性研究［J] . 生態(tài)學雜志, 2005, 24（6）：631-634.

［6] Pornsunthorntawee O, Wongpanit P, Chavadej S, et al. Structural and Physicoehemical charaeterization of crude biosurfactant produced byPseudomonas aerugjnosaSP4 isolated from petroleum eontaminated soil［J] . Bioresource Technology, 2008, 99（6）：1589-1595.

［7] 張秋卓, 蔡偉民. 生物表面活性劑產生菌的篩選及產劑性能研究［J] . 環(huán)境科學與技術, 2008, 31（11）：38-40.

［8] 張翠竹, 梁鳳來, 張心平, 等.一種脂肽類生物表面活性劑的理化性質及其對原油的作用［J] .油田化學, 2000, 17（2）：172-176.

［9] 鄧勇, 易紹金.稠油微生物開采技術現狀及進展［J] .油田化學,2006, 23（3）：289-292.

［10] 寧長發(fā), 沈薇, 孟廣榮, 等.產生生物表面活性劑菌種的一種快速篩選模型［J] .微生物學通報, 2004, 31（3）：55-58.

［11] 沈薇, 楊樹林, 寧長發(fā), 等.藍色凝膠平板法篩選生物表面活性劑產生菌［J] .南京理工大學學 報, 2005, 29（4）：486-490.

［12] Arino S, Marehal R, Vandeeasteele JP. Identifieation and production of a rhamnolipic biosurfactant by aPseudomonasspecies［J] .Appl Microbiol Biotechnol, 1996, 45（2）：162-168.

［13] 孫燕, 洪青, 李順鵬. 一株生物表面活性劑產生菌的分離及其特性研究［J] . 微生物學通報, 2009, 36（8）：1110-1116.

［14] 包木太, 趙東維, 陸金仁, 等. 芽孢桿菌Lz-2在堿性環(huán)境下產糖脂類表面活性劑的研究及增溶作用初b探［J] . 中國海洋大學學報, 2013, 43（10）：76-82.

［15] Youssef NH, Duncan KE, Nagle DR, et al. Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse micro-organisms［J] .Jounal of Microbiological Methods, 2004, 56（3）：339-347.

［16] 高小朋, 姜釗, 高秀梅, 等. 石油降解菌產表面活性劑的條件優(yōu)化［J] . 環(huán)境工程學報, 2013, 7（8）：3244-3248.

［17] 劉程, 米裕民.表面活性劑性質理論與應用［M] .北京：化學工業(yè)出版社, 2003：45-52.

［18] 劉暢, 趙偉, 劉濤, 等. 一株產表面活性劑低溫細菌的篩選與鑒定［J] . 生態(tài)學雜志, 2013, 32（4）：1075-1082.