EB病毒融合蛋白Zta-P54在大腸桿菌中的表達、純化及鑒定

王云龍 張春艷 李玉林 程蕾 王繼創 鄧黎黎 米海 白曉靜

（1.鄭州大學生物工程系，鄭州 450001；2.鄭州職業技術學院，鄭州450046；3.河南省生物工程技術研究中心，鄭州 450001）

EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬于人類皰疹病毒 γ 亞科，具有較強傳染性和潛伏感染的特點。該病毒在裂解期主要表達立早蛋白、早期蛋白和晚期蛋白3種蛋白［1]。有研究報道［2]，鼻咽癌的發生發展和EB病毒感染密切相關，在鼻咽癌病人血清中可以檢測到EB病毒相關抗體。由于不同感染狀態下 EBV 表達的抗原各不相同，因此研究者常通過基因工程或人工合成多肽等方法獲得EB病毒抗原，作為臨床輔助診斷的依據［3]。

BZLF1編碼的Zta立早蛋白可促使EB病毒從潛伏狀態進入增殖狀態，且Zta有較好的抗原性［4]，可用于鼻咽癌的診斷及預測。另外，有研究報道［5]，BMRF1編碼的P54蛋白是EB病毒的早期蛋白，以EB病毒早期抗原（包括P54蛋白）作為抗原基質建立ELISA法，檢測血清中相應抗體，對鼻咽癌診斷有好的特異性和敏感性。Dardari等［6]和Chan等［7]的報道及Chan等［8]在世界衛生組織腫瘤組織學分類一書中的觀點，均認為血清學方法診斷鼻咽癌，采用幾種抗原聯合檢測能顯著提高特異性和敏感度。

為探討可溶性多抗原聯合檢測在血清學診斷鼻咽癌中的價值，本研究嘗試用pET32a作為表達載體，純化Zta-P54融合蛋白作為診斷抗原，以期為后期該蛋白的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和宿主菌 pGEX5T-BZLF1-BMRF1質粒、表達菌BL21（DE3）由河南省生物工程技術研究中心提供，表達載體pET32a購自Novagen公司。

1.1.2 引物設計 根據pGEX5T-BZLF1-BMRF1測序結果，應用Primer 5.0軟件設計引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.1.3 主要試劑 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司；蛋白Marker、Taq酶、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA連接酶購自天根生化科技（北京）有限公司；鼻咽癌患者的血清取自鄭州大學第一附屬醫院；限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ購自New England Biolabs公司；DNA膠回收試劑盒購自寶生物公司，Ecl化學發光試劑盒購自PIERCE公司，PVDF轉印膜購自PALL公司，其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增及原核表達載體的構建 根據所設計引物，建立30 μL PCR反應體系：（5 ×buffer，6 μL；MgCl2，1 μL；dNTP，0.3 μL；上游引物，0.2 μL；下游引物，0.2 μL；Taq酶，0.5 μL；模板，0.5 μL；ddH2O，21.3 μL），反應條件：95℃5 min；95℃ 1 min；60℃ 35 s；72℃ 1.5 min；40個循環，72℃ 5 min。將擴增產物與pET32a載體分別經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，切取目的基因條帶，用DNA膠回收試劑盒分別回收目的片段和載體片段。由T4 DNA 連接酶16℃過夜連接雙酶切產物，構建重組質粒；將重組質粒轉入宿主細胞BL21（DE3）中，涂布于固體LB培養基中（含Amp），37℃過夜培養。挑取陽性克隆菌落培養至OD值0.6左右，提取質粒，將提取質粒經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切正確的產物送至上海生工測序，將測序正確地質粒命名為pET32a/BZLF1-BMRF1。

1.2.2 重組蛋白誘導表達條件優化 挑取陽性菌落，接種于3.5 mL LB液體培養基（含Amp）中，37℃條件下過夜培養，次日取菌液100 μL轉接到含有氨芐抗生素的3.5 mL LB培養基中。當培養至OD600約為0.5-0.6時，加入IPTG誘導，以空載體pET32a作為對照。根據實驗室的經驗，同時對菌體進行溫度、誘導劑濃度、誘導時間等條件的優化，對不同表達條件的菌體進行SDS-PAGE鑒定，選取最優表達條件。

1.2.3 表達菌體的純化前期處理 取穩定表達的菌種1 mL接種到1 L的LB液體培養基（含Amp）中，在最佳條件下誘導表達，離心收集菌體。用pH7.8 6 mol/L尿素重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎。離心，取上清進行飽和硫酸銨沉淀，離心，取沉淀透析出去硫酸銨，用pH 7.8 6 mol/L尿素溶解沉淀。將處理過的菌液進行DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA親和層析純化。采用紫外分光光度計測定純化蛋白的含量，按以下公式計算蛋白濃度：

蛋白濃度（mg/mL）= A280×1. 45-2 A260×0. 74。1.2.4 融合蛋白Zta-P54的DEAE-Sepharose CL-6B純化 柱床體積40 mL（3.5 × 4 cm）pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素平衡柱子，用5倍柱體積的0.1、0.5、1.0、2.0 mol/L NaCl，pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素進行線性梯度洗脫，流速1.5 mL/min，收集樣品進行SDS-PAGE檢測。并通過Photoshop分析蛋白灰度并計算蛋白純度。

1.2.5 融合蛋白Zta-P54的Ni-NTA親和柱純化 將DEAE-Sepharose CL-6B柱純化的最佳洗脫蛋白經AKTAPrime plus純化儀泵入Ni-NTA親和柱純化，柱床體積25 mL（2.5×5 cm）pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素平衡柱子，用5倍柱體積的20、50、100、200 mmol/L 咪唑，pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素進行線性梯度洗脫，流速1.5 mL/min，收集樣品進行SDS-PAGE檢測。分析蛋白灰度并計算蛋白純度。

1.2.6 Western blot檢測蛋白特性 相同上樣量的前期試驗純化的包涵體融合蛋白Zta-P54和本試驗純化后融合蛋白Zta-P54，經SDS-PAGE，切膠轉膜處理，用10 mg/L的BSA封閉2 h。PBST洗滌4次。加入鼻咽癌患者陽性血清為一抗陽性對照，空質粒為陰性對照，37℃溫浴1.5 h，PBST洗膜4次。加入HRP標記的鼠抗人-IgG作為二抗，37℃溫浴2 h，PBST清洗后，再用蒸餾水清洗，然后加入Ecl化學發光顯色液顯色5 min，暗室曝光1 min，顯影1 min定影6 min，最后結果分析并拍照記錄。

2 結果

2.1 重組基因的核酸電泳鑒定

將擴增產物BZLF1-BMRF1和重組質粒pET32a/BZLF1-BMRF1酶切產物進行1 %瓊脂糖電泳分析，結果見圖1，圖2。

由圖1可以發現約在1 600 bp處的目的條帶，其大小與預期結果相符合；圖2顯示NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切前有一較亮的質粒條帶，質粒雙酶切后可以看出約1 600 bp處目的條帶，與預期結果相符。

圖1 BZLF1-BMRF1 PCR擴增

圖2 重組質粒酶切鑒定

2.2 融合蛋白Zta-P54誘導表達條件優化

對菌體進行溫度、誘導劑濃度、誘導時間等表達條件的優化，并進行SDS-PAGE鑒定。

重組的質粒經不同IPTG濃度誘導，電泳檢測誘導表達結果，通過灰度分析，顯示在IPTG濃度為0.2 mmol/L時蛋白表達量最高，見圖3，圖4。

圖3 IPTG優化電泳檢測

圖4 IPTG灰度分析圖

重組的質粒在37℃條件下，IPTG濃度為0.2 mmol/L時，改變誘導時間，經電泳檢測并對電泳結果進行灰度分析，結果發現誘導6 h時蛋白表達量最高見，圖5，圖6。

IPTG濃度為0.2 mmol/L時，通過改變誘導溫度發現37℃條件下誘導6 h時蛋白表達量最高見圖7，圖8。

綜上所述，條件優化后，最終得到最佳誘導表達條件為37℃，0.2 mmol/L IPTG誘導6 h蛋白表達量最高，蛋白分子量約為60 kD，與預期結果一致。

2.3 融合蛋白的可溶性分析及蛋白純化

將重組質粒在最佳條件下誘導表達、收集菌液、離心菌體、破菌、分上清和沉淀電泳分析蛋白可溶性，發現該蛋白在大腸桿菌中可溶性表達（圖9）通過DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA親和層析純化，經SDS-PAGE和Photoshop進行灰度分析（圖10）。

圖5 誘導時間優化電泳檢測

圖6 時間灰度分析

圖7 誘導溫度梯度優化電泳檢測

圖9 重組蛋白Zta-P54可溶性表達電泳

圖10 重組蛋白Zta-P54的純化

由圖9顯示目的蛋白Zta-P54主要以可溶性的形式存在；經SDS-PAGE和Photoshop軟件灰度分析發現（圖10）通過DEAE柱純化后Zta-P54蛋白的總灰度為9 730，總條帶灰度為12 139，計算得出蛋白純度80 %；經Ni-NTA親和柱純化后蛋白的總灰度為27 435，總條帶灰度為28 441，計算得出蛋白純度96.5 %，采用紫外分光光度計法測定純化后蛋白總量為18 mg，即1 L菌液可以純化得到18 mg Zta-P54融合蛋白。

2.4 Western blot結果分析

通過Western blot檢測融合蛋白 Zta-P54免疫原性及反應特異性，表達產物Zta-P54為陽性對照，空質粒為陰性對照，加入鼻咽癌患者陽性血清反應，結果見圖11，圖12。由圖11，圖12可知，融合蛋白Zta-P54與鼻咽癌患者陽性血清混合反應后，在60 kD出現特異性反應帶；而空載質粒pET32a相應位置沒有條帶出現，且可溶性Zta-P54融合蛋白較包涵體Zta-P54融合蛋白有更好的反應特異性。

3 討論

圖11 Western blot檢測

圖12 Western blot灰度分析

EB病毒作為一種嗜B淋巴細胞的人類皰疹病毒，它與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、單核細胞增多癥等疾病的發生密切相關。目前廣東地區鼻咽癌的發病率較高，且已經成為一種較典型的地方性惡性腫瘤疾病，所以鼻咽癌的早期診斷尤為必要，其中用EB病毒抗原檢測病人血清中的抗EB病毒的抗體用來篩查鼻咽癌這一疾病的研究備受關注［9]。目前，隨著分子生物學與免疫學技術的發展，已經有多種EB病毒抗原通過基因工程表達和人工合成的方式被純化出來，并且用作診斷抗原進行了ELISA法、化學發光免疫分析法等方法的研究［10，11]，這些單個診斷抗原雖然提高了特異性，但敏感度還不夠。因此，可以應用多種EB病毒抗原聯合檢測，不但可拓寬了抗體反應譜，還可以提高ELISA法的敏感度［12]。

目前，張毅等［13]報道所表達的EB病毒融合抗原多以包涵體形式表達。為提高蛋白活性，本研究選擇抗原性較好的立即早期蛋白Zta和早期蛋白P54融合表達。由于前期研究發現pGEX5T-BZLF1-BMRF1載體所表達的Zta-P54蛋白為包涵體［14]，所以更換pET32a作為表達載體，該載體帶有的Trx標簽是高度可溶性多肽，增強了目的蛋白的可溶性。同時，本研究所選序列引入有一段24 bp的連接肽，它編碼的氨基酸為GGGGSGGG，其中甘氨酸沒有手性碳原子，柔性較好，在融合蛋白之間不會影響兩邊蛋白各自的構象和功能；而絲氨酸是親水性最強的氨基酸，可以提高融合蛋白的親水性。將兩種氨基酸串聯起來作為連接肽可以保持兩蛋白原有的生物活性。通過優化誘導溫度、時間、誘導劑濃度等條件，實現了Zta-P54的可溶性表達。Western blot檢測發現可溶性蛋白較包涵體蛋白反應特異性性強，克服了包涵體蛋白活性低的缺點。試驗發現在溫度為37℃、誘導時間6 h、IPTG濃度0.2 mmol/L 的條件下目的蛋白表達量最高。試驗過程發現該蛋白較易降解，所以純化前用6 mol/L尿素處理菌體及飽和硫酸銨沉淀目的蛋白。這一過程既除去了部分雜蛋白又有效的減緩了融合蛋白Zta-P54的降解。最后，通過DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA親和層析純化，得到純度高達96.5%的Zta-P54融合蛋白，收率可達到18 mg/L。Western blot檢測表明該蛋白可與鼻咽癌患者血清中相應抗體發生特異性結合，有良好的免疫原性及反應特異性。Zta-P54蛋白是我們表達的一種全新的兩抗原融合蛋白，將該蛋白應用到鼻咽癌早期診斷和篩查中將會有更好的敏感度和特異性，可降低鼻咽癌的漏診率，且可利用原核表達方法快速、大量生產該蛋白。

4 結論

本試驗成功純化得到可溶性、高純度的融合蛋白Zta-P54，且該蛋白有較好的免疫原性，Zta-P54融合蛋白在EB病毒相關疾病的診斷上將具有良好的臨床應用前景。

［1] Feederle R, Kost M, Baumann M, et al. The Epstein-Barr virus lytic program is controlled by the co-operative functions of two transactivators［J] . EMBO J, 2000, 19（12）：3080-3089.

［2] 顧耀亮, 張昌卿, 吳子柏, 等．抗重組EB病毒雙重抗體鼻咽癌血清學研究［J] ．癌癥, 2003, 22（9）：903-906．

［3] Islam MS, Anoop P, Gordon-Smith EC, et al. Epstein-Barr virus infections after allogeneic stem cell transplantation A comparison between nonmalignant and malignant hematological disorder［J] .Hematology, 2010, 15（5）：344-350.

［4] Chan KH, Gu YL, Ng F, et al. EBV specific antibody-based and DNA-based assays in serologic diagnosis of nasopharyngeal carcinoma［J] . Cancer, 2003, 105（5）：706-709.

［5] Paramita DK, Fachiroh J, Artama WT, et al. Native early antigen of Epstein-Barr virus a promissing antigen for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma［J] . J Med Virol, 2007, 79（11）：1710-1721.

［6] Dardari R, Hinderer W, Lang D, et al. Antibody responses to recombinant Epstein-Barr virus antigens in nasopharyngeal carcinoma patients：Complementary test of ZEBRA protein and early antigens p54 and p138［J] . J Clin Micro, 2001, 39（9）：3164-3169.

［7] Chan KH, Gu YL, Ng F, et al. EBV specific antibody-based and DNA-based assays in serologic diagnosis of nasopharyngeal carcinoma［J] . Int J Cancer, 2003, 105（4）：706-709.

［8] Chan JKC, Pilch BZ, Bray F, et al. Nasopharyngeal carcinoma［M] //Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology&Genetics. Head and Neck Tumours. Lyon France：IARC-Press, 2005：85-97.

［9] Allen MD, Young LS, Dawson CW. The Epstein-virus encoded LMP2A and LMP2B proteins promote epithelial cell spreading and motility［J] . Virol, 2005, 79（6）：1789-1802.

［10] 伊強, 王文華, 陳丹, 等．以合成肽為抗原建立ELISA試驗檢測鼻咽癌患者EB病毒抗體的研究［J] ．中華腫瘤防治雜志,2008, 15（8）：610-611．

［11] Hoebe EK, hutajulu SH, VanBeek J, et al. Purified hexameric Epstein-virus encoded BARF1 protein for measuring anti-BARF1 antibody responses in nasopharyngeal carcinoma patients［J] .Clin Vaccine Immunol, 2011, 18（2）：298-304.

［12] Fachiroh J, Stevens SJ, Haryana SM, et al. Combination of Epstein-virus scaffold（BDRF1/VCA-p40）and small capsid protein（BFRF3/VCA-p18）into a single molecule for imprived serodiagnosis of acute and malignant EBV-driven disease［J] . J Virol Methods, 2010, 169（1）, 79-86.

［13] 張毅, 周淑艷, 孫業紅, 等．EB病毒融合蛋白 ztaN-p23 在大腸桿菌中的表達、純化及活性鑒定［J] ．細胞與分子免疫學雜志, 2012, 28（2）：120-123．

［14] 伊強.以原核表達的EB病毒融合蛋白p54-ztaN為抗原建立ELISA方法及其在鼻咽癌診斷中的應用［D] .福建：福建醫科大學, 2008．