蘋果樹腐爛病菌胞外蛋白提取方法

王海英 何媛媛 黃麗麗 韓青梅

（1.西北農林科技大學植物保護學院，楊凌 712100；2.旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，楊凌 712100；3.西北農林科技大學理學院，楊凌 712100）

蘋果樹腐爛病（Apple valsa canker）是蘋果生產中危害最嚴重的病害，由黑腐皮殼真菌Valsa maliMiyabe & Yamade引起［1，2]。目前我國和日本已經就病菌的擴展定植［3]主要的致病物質［4-6]等問題進行了研究，但仍沒有充分證據證明病菌產生的哪些胞外物質與致病性密切相關，對其致病機制了解甚少。因此，深入研究蘋果樹腐爛病菌的致病物質及其產生機制可為有效防治病害提供科學依據。

蛋白質組學已廣泛應用于病原與寄主互作的研究中，它可以將基因組序列信息和在特定條件中執行生命功能的蛋白質有機地聯系起來，并全面檢測不同組織器官所表達的蛋白質及在不同發育階段、不同條件下蛋白質表達的差異。iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）是蛋白質組學領域一項新的同位素標記技術，它克服了二維電泳（2-DE）對低豐度蛋白、膜蛋白、偏堿蛋白，分子量偏大或偏小蛋白的分離和檢測困難的缺點［7]，蛋白定量更準確，但該技術對樣品的蛋白含量和質量要求較高，限制了該技術在低表達的胞外蛋白上的應用和發展［8]。目前胞外蛋白提取方法有：發酵液冷凍干燥法［9]，這種方法適用于高含量胞外蛋白的提取；有機溶劑沉淀法，這種方法弊端是至少加入3倍發酵液體積的有機溶劑［10]，不適合大體積發酵液中胞外蛋白提取。本試驗中蘋果樹腐爛病菌Valsa mali在正常生長狀態下分泌的蛋白較少，分離沉淀困難。因此，建立一種高效的胞外蛋白質提取方法，以獲取種類和數量較多的胞外蛋白是該菌進行胞外蛋白質組學實驗的重要前提。

本研究通過比較液體發酵培養條件下2種蛋白提取方法對蘋果樹腐爛病菌胞外蛋白的提取效率，選擇其中能夠提取盡可能多的高質量的胞外蛋白的方法，旨在為后續蘋果樹腐爛病菌胞外蛋白質組學的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用蘋果樹腐爛病菌野生型菌株8#由本實驗室分離獲得并于-80℃冰箱保存。蛋白質組學試劑均購自MP公司，其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 直接冷凍干燥/透析 參照常明等［11]的方法，略有改動。將500 mL發酵濾液分裝于50 mL的離心管中，冷凍干燥至粉末。粉末用MilliQ水重新溶解，將重新溶解的溶液在MilliQ水中進行透析（4℃，約24 h），4℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液再次冷凍干燥（-104℃ 約48 h）。最后用水化上樣緩沖液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.065 mol/L CHAPS，0.1 mol/L DTT，0.001% Bio-Lyte）重新懸浮，放于-80℃備用。

1.2.2 DOC-10%TCA沉淀法 參照Schwarz等［12]的方法略有改動，向500 mL發酵濾液中均勻加入DOC至其終濃度為0.02%（W/V），處理后的濾液冰上靜置30 min，然后緩慢滴入已配好 10%（W/V）的TCA，同樣冰上靜置30 min后4℃、10 000 r/min離心10 min，去掉上清，并用96%冰乙醇徹底清洗沉淀，重復上述離心及清洗過程2-3次；最后清洗后的沉淀用水化上樣緩沖液（同1.2.1）重新懸浮，放于-80℃備用。

1.2.3 硫酸銨沉淀法 5份500 mL發酵濾液置于冰浴環境，260 r/min攪拌，少量緩慢加入硫酸銨粉末，分別至硫酸銨終濃度為50%、60%、70%、80%和90%，沉淀過夜；4℃、10 000 r/min離心30 min［10]，沉淀用磷酸緩沖液溶解后裝入已處理的透析袋并置于MilliQ水中透析，BaCl2檢測無沉淀后，將蛋白粗提液4℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液冷凍干燥，蛋白干粉用水化上樣緩沖液（同1.2.1）重新懸浮，-80℃保存。

1.2.4 蛋白粗品質量及蛋白含量的測定 不同方法獲得的蛋白粗品冷凍干燥至恒重后稱重。利用水化上樣緩沖液（同1.2.1）溶解蛋白粗品，Bradford法［13]測定蛋白溶液濃度并計算總蛋白量。標準品為牛血清白蛋白（1 mg/mL），根據不同濃度標準品在595 nm 波長處的吸光度值繪制標準曲線，得到計算公式，即可算出蛋白質濃度，并進一步計算溶液中總蛋白量。然后由蛋白粗品質量和Bradford檢測到的總蛋白量計算蛋白相對含量，數據由3次生物學重復試驗獲得，并經過SPSS16.0軟件中Duncan模型進行P=0.05水平的顯著性分析。

1.2.5 蛋白樣品SDS-PAGE電泳檢測 硫酸沉淀法中蛋白獲得量最高的樣品與冷凍干燥/透析法、DOC-10%TCA法的蛋白樣品進行12% 分離膠，5%濃縮膠的SDS-PAGE，考馬斯亮藍G-250染色，比較蛋白樣品的電泳圖譜的分辨率。

1.2.6 野生菌株8#及其突變體X900的SDS-PAGE條帶差異比較 選擇3種方法中提取效率最高的方法提取蘋果樹腐爛病菌野生型強致病菌株8#及其不致病突變體X900的胞外蛋白，實驗經過3次生物學重復獲得蛋白樣品進行12% SDS-PAGE電泳，分析同一菌株不同批次提取的蛋白樣品的重復性，以及不同菌株的胞外蛋白之間SDS-PAGE圖譜差異。

2 結果

2.1 胞外蛋白粗品質量及蛋白含量分析比較

冷凍干燥/透析法、DOC-10%TCA沉淀法及不同濃度硫酸銨沉淀法提取的蛋白粗品稱重、Bradford法檢測的蛋白總量并根據1.2.5中公式計算蛋白相對含量，在P=0.05水平進行差異顯著性分析結果如表1所示，50%-80%硫酸銨終濃度沉淀獲得的蛋白粗品質量隨硫酸銨濃度提高而顯著增加，而至90%時蛋白粗品質量未明顯增加；DOC-10%TCA與50%硫酸銨沉淀獲得的蛋白粗品質量最少，無顯著差異；冷凍干燥/透析法獲得的粗蛋白質量最高。利用Bradford法檢測粗蛋白中蛋白總量，結果表明70%硫酸銨沉淀的蛋白粗品中蛋白總量明顯高于其他硫酸銨濃度以及冷凍干燥/透析法和DOC-10%TCA法，而蛋白相對含量與DOC-10%TCA沉淀法無明顯區別，在所有方法中最高。

表1 不同方法獲得蛋白粗品質量及蛋白定量結果

2.2 冷凍干燥/透析、DOC-10%TCA、70%硫酸銨提取的樣品SDS-PAGE電泳

將冷凍干燥/透析法、DOC-10%TCA法及70%硫酸銨沉淀法獲得的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，結果（圖1）顯示，70%硫酸銨沉淀的蛋白（b1、b2）可辨認條帶最多，而且濃度較高。在14.4-25.0 kD范圍內，冷凍干燥/透析法蛋白樣品（a1、a2）幾乎沒有條帶，DOC-10%TCA法提取的樣品有蛋白條帶，但可辨認的蛋白條帶較少，而70%硫酸銨沉淀的蛋白樣品（b1、b2）條帶較多，分辨率和濃度較高；在25-66.2 kD分子量范圍內冷凍干燥/透析法提取的樣品蛋白條帶比較清晰，圖中箭頭A所指的蛋白濃度較高，但條帶數量較少，總蛋白濃度很低，DOC-10%TCA法提取的蛋白樣品條帶較前者多，但分辨率低，70%硫酸銨沉淀的蛋白樣品條帶最多、分辨率最高，只是接近66.2 kD大小處的蛋白條帶B濃度低于A條帶；大于66.2 kD分子量范圍內，冷凍干燥/透析的蛋白樣品條帶很少且非常微弱，70%硫酸銨和DOC-10%TCA獲得的蛋白樣品中的條帶相對較多，但分辨率均較低。

圖1 三種方法提取的蛋白樣品SDS-PAGE電泳

2.3 不同致病菌株胞外蛋白SDS-PAGE比較

采用70%濃度硫酸銨提取8#及其不致病突變體菌株X900發酵液中的胞外蛋白，3次重復試驗獲得的蛋白樣品進行12% SDS-PAGE電泳，電泳部分圖譜（圖2）顯示，該提取方法獲得的蛋白樣品分辨率較高、重復性較好。兩株菌的差異蛋白條帶明顯，3個蛋白條帶a、b、c只在8#（4、5、6泳道）中存在，在突變體X900（1、2、3泳道）中缺失；而圖中蛋白條帶d在突變體X900中表達，在野生型8#未表達。

圖2 強弱致病菌株胞外蛋白SDS-PAGE電泳

3 討論

冷凍干燥/透析法是一種簡單、方便的胞外蛋白質提取方法。Medina等［9]在分析黃曲霉外泌蛋白質組學時利用冷凍干燥法獲得較多的黃曲霉外泌蛋白，電泳圖譜效果比較理想。本試驗用該方法獲得的蛋白樣品經Bradford定量，結果顯示蛋白含量很高，而SDS-PAGED電泳條帶少而弱，原因可能是黃曲霉外泌蛋白表達較高，簡單的冷凍干燥法能夠提取足夠多的胞外蛋白。蘋果樹腐爛病菌胞外蛋白分泌很少，提取的粗蛋白干粉未經過沉淀分離，蛋白粗品中培養基成分，如可溶性淀粉較多，蛋白含量很低，導致蛋白干粉溶解時呈黏稠狀，過高估計了蛋白定量結果［14]。

DOC-10%TCA沉淀法是較為常用的胞外蛋白樣品制備技術，Schwarz等［12]利用DOC-10%TCA沉淀法獲得的丙酮丁醇梭菌的胞外蛋白質量明顯好于PEG6000和丙酮沉淀兩種方法。常明等［11]在探索稻瘟病菌胞外蛋白提取方法時也證明DOC-10%TCA沉淀法比冷凍干燥法更適合稻瘟病菌的胞外蛋白的提取。本實驗中用該方法提取的蘋果樹腐爛病菌胞外蛋白雖然濃度較高，但蛋白樣品分辨率很低，可能原因是TCA沉淀了實驗所用培養基中的某些成分，樣品需要進一步純化，所以如果將該方法用于本實驗胞外蛋白的提取，有待對蛋白樣品作進一步純化以提高樣品分辨率。

硫酸銨沉淀法是一種經典的蛋白質提取方法，Jiang等［10]比較了TCA沉淀、丙酮沉淀、超濾、硫酸銨沉淀及氯仿/甲醇5種蛋白提取方法對人體血漿蛋白的提取效果，結果表明5種提取方法電泳圖譜效果沒有明顯差異，但是有機溶劑沉淀時使用的有機試劑至少是3倍發酵濾液體積［10]，離心工作量增加，不適合用于大體積發酵液蛋白質的提取。同時在探索沉淀血漿蛋白的理想硫酸銨濃度時，70%硫酸銨沉淀的血漿蛋白量是50%硫酸銨濃度的2倍多，這點與本實驗結果一致。本實驗運用70%硫酸銨鹽析法提取Valsa mali胞外蛋白，蛋白含量和分辨率最高。繼續增加硫酸銨濃度可能導致發酵液中其他大分子物質一起沉淀，增加了蛋白粗品的質量，原本沉淀的某些蛋白隨硫酸銨濃度增加溶解度改變，重新復溶，導致蛋白含量降低。本實驗在硫酸銨沉淀后避免用導致蛋白損失的冰丙酮洗滌法對蛋白進行純化［10]，而是增加了透析、低速離心去除鹽離子和不溶性多糖，從而保證了較高的蛋白回收率和分辨率。

4 結論

本試驗通過比較 3 種蛋白提取方法獲得的胞外蛋白粗品質量和蛋白含量，以及 SDS-PAGE 電泳圖譜分析，初步明確 70% 硫酸銨沉淀的胞外蛋白粗品中蛋白總量及相對含量較為理想、SDS-PAGE 電泳圖譜分辨率最高，且重復性好。用該方法提取的不同致病力的蘋果樹腐爛病菌的胞外蛋白 SDS-PAGE電泳圖譜差異明顯。由此證明，該方法更適合蘋果樹腐爛病菌胞外蛋白差異比較時蛋白的提取。

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