水葫蘆胞質型谷氨酰胺合成酶EcGS1全長cDNA的克隆及序列分析

蔣麗花 傅明輝 李園枚 嚴國花 鄭李軍 陳肖麗 彭進平

（廣東工業(yè)大學輕工化工學院，廣州 510006）

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）是植物將無機氮轉化為有機氮的第一個酶，與谷氨酸合成酶（Glutamate synthetase，GOGAT）聯合作用催化氨的同化，使其轉變成谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu），Gln和Glu是高等植物體內含氮有機物的生物合成最主要的供體［1]。因此GS是植物氮代謝中的關鍵酶，與植物對氮素的利用［2，3]，植物的產量和品質［4]、植物的抗逆性密切相關［5-7]。高等植物中存在多種GS同工酶形式。根據亞細胞定位，植物的GS分為兩大類，一類是胞質型或胞液型GS（GS1），一類是質體型或葉綠體型GS（GS2）。GS1為多基因編碼，目前發(fā)現在水稻中有3個［8]，擬南芥有5個［9]，玉米有5個［10]，土豆有2個［11]，楊樹有3個［12]。GS2一般為單基因編碼，僅在苜蓿種子的發(fā)育中發(fā)現了第二個GS2基因［13]。GS2的亞基的分子量為44-45 kD左右，而GS1的亞基的分子量小于38-40 kD。GS2亞基多肽的N端存在一個由50個左右的氨基酸組成的信號肽序列，起到指導其向質體定位的作用，C端存在一個GS2亞基特有的由16個氨基酸組成的保守區(qū)。GS1和GS2在植物體內起著不同的作用。GS1主要同化內源性蛋白質降解和氨基酸分解代謝產生的氨，并可能在氮素的轉運中起作用，主要參與種子萌發(fā)時儲存氮源的轉運及葉片衰老時氮源的轉移及再利用。GS2則同化經硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶催化產生的氨，以及同化光呼吸作用產生的氨［14]。

水葫蘆（Eichhomia rassipes）學名鳳眼蓮，屬雨久花科鳳眼蓮屬植物，是亞熱帶和溫帶淡水水面廣泛生長的一種水草。水葫蘆對水體中的氮素利用效率非常高，在富營養(yǎng)化水體中泛濫生長，破壞水體生態(tài)平衡，但適量的水葫蘆也可凈化水質，用于富營養(yǎng)化湖泊［15，16]及河道［17]、養(yǎng)殖廢水［18，19]、工業(yè)廢水［20，21]等方面的處理。水葫蘆為何能夠高效利用富營養(yǎng)化水體中的氮素，目前所有的研究僅在生理生化的水平上［22，23]，還未深入到分子水平。

本研究以水葫蘆谷氨酰胺合成酶cDNA為模板，克隆水葫蘆胞質型谷氨酰胺合成酶（EcGS1）基因，推測其氨基酸序列，分析其中的保守片段，預測該序列編碼蛋白的亞細胞定位，比較該序列與其他植物中相關序列之間的相似性，并構建分子進化樹，旨在為進一步深入研究EcGS1基因的功能，揭示水葫蘆高效利用氮素的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 水葫蘆采自廣州市安檢水庫。

1.1.2 主要試劑 RNAiso plus 總RNA提取試劑盒、Prime ScriptTMRT-PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit 試劑、pMD19-T vector、RACE 試劑盒均購于TaKaRa；E. coliDH5α、DNA Marker、Taq酶、dNTP均購自鼎國昌盛生物技術（北京）有限公司。其他生化試劑和常規(guī)試劑均為超純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 根據已公布的其他植物GS1氨基酸保守序列，用在線軟件ICODEHOP設計簡并引物，結合5'-Full RACE Kit，3'-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒中的克隆方法設計進行RACE PCR，所用引物由Invitrogen廣州公司合成，序列信息詳見表1。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 取適量幼嫩的水葫蘆根，洗凈，用液氮充分研磨粉末，總RNA的提取方法按照RNAiso plus說明書進行。以提取的總RNA為模板，用Prime ScriptTMRTPCR Kit試劑盒方法進行逆轉錄合成cDNA，產物置于-20℃保存。

表 1 引物序列

1.2.3 EcGS1基因中間片段的擴增及克隆 以cDNA第一鏈為模板，采用簡并引物GS1F/GS1R，進行PCR擴增。反應體系為：ddH2O 17 μL，Taq酶0.5 μL，buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，模板 2 μL，上下游引物各1 μL。反應程序為：94℃預變性 5 min；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物電泳鑒定，回收，轉入T載體，用菌落PCR篩選陽性克隆測序。

1.2.4 5' RACE擴增及克隆 引物采用Primer 5軟件設計，根據EcGS1基因中間片段設計其5'端擴增的特異引物，聯合5' race outer primer/5' race inner primer，進行5'端的巢式PCR，反應體系同1.2.3，反應程序為：第1輪（5O聯合5' race outer primer），94℃預變性 5min；94℃ 30 s，40℃ 30 s（每循環(huán)升1℃），72℃ 1 min，20個循環(huán)；72℃延伸10 min。第2輪（5I聯合5' race inner primer），94℃ 5 min；94℃ 30 s，40℃/44℃/48℃/52℃/56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物電泳鑒定，回收，轉入T載體，用菌落PCR篩選陽性克隆測序。

1.2.5 3' RACE擴增及克隆 根據根據EcGS1基因中間片段和5'端片段的序列設計其3'端的特異引物（3O/3I1/3I2），聯合3' race outer primer/3' race inner primer 對EcGS1基因3'端進行巢式PCR，反應體系同1.2.3，第1輪（3O聯合3' race outer primer），擴增程序同5' RACE的第1輪反應，第2輪（3I1聯合3' race inner primer）和第3輪（3I2聯合3' race inner primer）擴增程序同5' RACE的第2輪反應，PCR產物的電泳鑒定，回收，轉入T載體，用菌落PCR篩選陽性克隆測序。

1.2.6 EcGS1基因全長獲得 根據EcGS1基因中間片段，5'端及3'端測序結果，拼接獲得全基因序列，對序列進行開放閱讀框的分析，設計引物（11/12），進行PCR。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物電泳鑒定，回收，轉入T載體，用菌落PCR篩選陽性克隆測序。

1.2.7 EcGS1基因序列分析 用ProtParam工具分析EcGS1蛋白的理化性質（http：//web.expasy.org/protparam/）。用PROSITE和SMART數據庫對EcGS1蛋白保守結構域進行分析（http：//www.expasy.Org/prosite，http：//smart.Embl-heidelberg.De/）。利用TargetP程序預測EcGS1蛋白的細胞亞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）。利用NCBI中BLASTX對NCBI蛋白質全庫進行相似性搜索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。利用ClustalW2進行多序列比對，用Mega4.1采用鄰接法構建分子進化樹。

2 結果

2.1 水葫蘆總RNA的提取

用紫外分光光度儀測定提取的水葫蘆總RNA，其OD260/280=2.0，OD260/230=2.5，說明所提取的總蛋白質和雜質污染較少，純度較高。總RNA經由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。

2.2 EcGS1基因中間片段克隆及測序

PCR產物經電泳檢測到一條單一條帶（圖 2），位于500 bp左右，進行克隆及測序，得到467 bp片段，通過BLAST分析，證實為GS相似序列。

2.3 5' RACE產物克隆及測序

圖 1 水葫蘆總RNA電泳圖

圖 2 EcGS1基因中間片段

經電泳檢測5' RACE第2輪擴增產物（圖 3），得到一條約400 bp片段，克隆測序后發(fā)現，去5'race inner 引物后367 bp，其84-86位為起始密碼子ATG，與EcGS1基因中間片段有140 bp重疊序列。

圖 3 EcGS1基因5'RACE擴增產物

2.4 3' RACE產物克隆及測序

經電泳檢測3' RACE第3輪擴增產物（圖 4），得到一條約900 bp條帶，進行克隆測序，去3' race inner primer 后序列為883 bp，內含mRNA 3'末端polyA，與EcGS1基因中間片段有143 bp重疊序列。

2.5 EcGS1基因cDNA全長獲得

將上述3條序列拼接，得到EcGS1基因的cDNA序列，共1 434 bp，提交NCBI，獲得序列登錄號為KF683089，采用ORF分析序列，表明其中含有1個1 071 bp完整開放閱讀框序列，編碼356個氨基酸殘基，ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。根據EcGS1基因的cDNA序列設計引物，用引物11/12從水葫蘆基因組DNA中擴增到約1 200 bp DNA片段，將其克隆測序后得到1 183 bp片段（圖5）。該測序結果與拼接結果及開放閱讀框分析結果完全一致，證實了試驗設計的正確性。

圖 4 EcGS1基因3'RACE擴增產物

圖 5 EcGS1基因全長片段

2.6 EcGS1基因編碼蛋白的氨基酸序列、保守結構域及亞細胞定位

用ProtParam分析EcGS1基因所編碼蛋白的氨基酸序列（圖6）顯示，該蛋白分子量為39.3 kD，等電點為5.52。用PROSITE數據庫分析該蛋白237-253氨基酸殘基為ATP結合區(qū)域（putative ATP-binding region）{K-P-［LIVMFYA] -x（3，5）-［NPAT] -［GA] -［GSTAN] -［GA] -x-H-x（3）-S}，11-14、185-188、251-254氨基酸殘基為N-糖基化序列（N-glycosylations）N-{P}-［ST] -{P}。用SMART分析，顯示EcGS1蛋白包含了一個GS beta-Grasp domain（17-97 AA）和一個GS catalytic domain（103-351 AA）。利用TargetP程序預測EcGS1蛋白序列不存在信號肽，為胞質蛋白。

2.7 EcGS1基因編碼的氨基酸序列與其他植物GS1相似性比對

運用NCBI的BLASTX對蛋白質序列全庫進行相似性搜索，選擇其中的13條序列相似性較高的不同植物的GS1氨基酸序列，利用ClustalW2，進行多序列比對，結果（表2）顯示，與其他物種的GS1氨基酸序列相似性在82%以上，其中與橡膠樹的相似性最高。說明了不同植物種間GS1在氨基酸序列上保守性較高。根據水葫蘆及其他植物的GS1氨基酸序列，用Mega4.1軟件構建GS1氨基酸序列的分子進化樹（圖7）。

表 2 水葫蘆與其他植物的GS1氨基酸序列相似性比較

3 討論

GS1蛋白和GS2蛋白都在細胞質中合成，GS1蛋白為胞質型蛋白，GS2蛋白像多數質體型的蛋白一樣，最初在細胞質中合成前體多肽，被基質內的有關酶切去N端的一段肽段后，被運輸到葉綠體內［24]。本試驗克隆了EcGS1基因cDNA序列，該序列編碼356個氨基酸的多肽鏈，通過BLAST相似性分析，證實EcGS1為GS1蛋白，通過TargetP程序預測，該序列沒有信號肽，為胞質型蛋白。EcGS1分子量大小為39.3 kD，與其他GS1分子量（38-40 kD）大小一致，而與GS2分子量（44-45 kD）明顯不同。

圖 6 EcGS1基因核苷酸序列和推導的氨基酸序列

圖 7 水葫蘆與其他物種GS1氨基酸序列的系統進化樹

EcGS1與其他13種不同類植物的GS1氨基酸序列相似性比較結果顯示，EcGS1氨基酸序列與橡膠樹的相似性最高，為93.0%，EcGS1氨基酸序列與歐洲赤松的相似性較高，為82.6%，說明了不同植物間的GS1在氨基酸序列上保守性較高。GS是植物利用環(huán)境中氮素的關鍵酶，在植物生理過程中占有重要地位，因此，在進化過程中承受了較大的選擇壓力，所以序列的保守性較高。通過EcGS1基因編碼的氨基酸序列保守結構域的分析，發(fā)現該酶含有ATP結合序列。Llorca等［25]采用電鏡和圖像技術結合生化數據也證實了植物谷氨酰胺合成酶分子中存在ATP結合位點。這點是與其功能相一致的，谷氨酰胺合成酶在催化谷氨酸與NH4+合成谷氨酰胺時，需要消耗ATP［14]。生物信息學分析發(fā)現該酶還含有多個保守的N-糖基化序列，在已報道的水稻［26]、油菜［27]、茶樹［28]等植物的GS1蛋白序列也存在這些保守序列。

從分子進化樹圖看，植物GS1的分子進化樹與物種進化樹并不一致。王小純等［29]報道，GS2分子進化樹與物種進化樹一致，而GS1的分子進化樹與物種進化樹并不一致，這點與本試驗結果相符合，王江和張景六［30]的分析亦得出同樣結論。一個可能的原因是GS1在進化中的分歧可能早于單子葉和雙子葉植物的分歧，但這點仍需要進一步數據證實。目前，與水葫蘆在進化上親緣關系較近的物種的GS1基因序列被測定的并不多，隨著今后更多的GS1基因序列被測定，GS1的分子進化歷程將會被更好地揭示。

有關水葫蘆分子生物學的研究有助于揭示水葫蘆高效利用富營養(yǎng)化水體中氮素的分子機理，為水葫蘆的進一步開發(fā)和利用提供理論基礎，能夠從分子水平上揭示水葫蘆這種外來入侵植物快速入侵的機理，探討從營養(yǎng)代謝角度調控其生長的可能性。

4 結論

利用RACE技術克隆得到水葫蘆胞質型谷氨酰胺合成酶EcGS1基因cDNA序列，序列登錄號為KF683089，序列長1 534 bp，開放閱讀框為1 071 bp，編碼356個氨基酸的多肽鏈，分子量為39.3 kD，等電點為5.52。EcGS1編碼的蛋白包含了ATP結合區(qū)域、N-糖基化位點、GS beta-Grasp功能區(qū)，GS催化功能區(qū)。EcGS1氨基酸序列與橡膠樹的GS1相似性最高，為93.0%。

［1] 韓娜, 葛榮朝, 趙寶存, 等.植物谷氨酰胺合成酶研究進展［J] .河北師范大學學報, 2004, 28（4）：407-410.

［2] Sun H, Huang QM, Su J. Highly effective expression of glutamine synthetase genes GS1 and GS2 in transgenic rice plants increases nitrogen-deficiency tolerance ［J] . Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2005, 31（5）：492-498.

［3] Man HM, Boriel R, El-Khatib R, Kirby EG. Characterization of transgenic poplar with ectopic expression of pine cytosolic glutamine synthetase under conditions of varying nitrogen availability ［J] .New Phytologist, 2005, 167（1）：31-39.

［4] Fuentes SI, Allen DJ, Ortiz-Lopez A, et al. Overexpression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations ［J] . Exp Bot, 2001, 52：1071-1081.

［5] Rana NK, Mohanpuria P, Yadav SK. Expression of tea cytosolic glutamine synthetase is tissue-specific and induced by cadmium and salt stress ［J] . Biologia Plantarum, 2008, 52（2）：361-364.

［6] Lee HJ, Abdula SE, Jang DW, et al. Overexpression of the glutamine synthetase gene modulates oxidative stress response in rice after exposure to cadmium stress ［J] . Plant Cell Rep, 2013, 32：1521-1529.

［7] Pascual MB, Jing ZP, Kirby EG, et al. Response of transgenic poplar overexpressing cytosolic glutamine synthetase to phosphinothricin［J] . Phytochemistry, 2008, 69：382-389.

［8] Tabuchi M, Sugiyama K, Ishiyama K, et al. Severe reduction in growth rate and grain filling of rice mutants lacking OsGS1；1, a cytosolic glutamine synthetase1；1 ［J] . The Plant Jounal, 2005,42：641-651.

［9] Ishiyama K, Inoue E, Tkahashi AW, et al. Kinetic properties and ammonium-dependent regulation of cytosolic isoenzymes of glutamine synthetase inArabidopsis［J] . Biol Chem, 2004, 279（16）：16598-16605.

［10] Martin A, Lee J, Kichey T, et al. Two cytosolic glutamine synthetase isoforms of maize are specifically involved in the control of grain production ［J] . The Plant Cell, 2006, 18：3252-3274.

［11] Teixeira J, Pereira S, Cánovas F, et al. Glutamine synthetase of potato（Solanum tuberosumL. cv.Désirée）plants：cell- and organ-specific expression and differential developmental regulation reveal specific roles in nitrogen assimilation and mobilization ［J] .Experimental Botany, 2005, 56（412）：663-671.

［12] Castro-Rodríguez V, García-Gutiérrez A, Canales J, et al. The glutamine synthetase gene family inPopulus［J] . BMC Plant Biology, 2011, 11：119.

［13] Seabra AR, Vieira CP, Cullimore JV, et al.Medicago truncatulacontains a second gene encoding a plastid located glutamine synthetase exclusively expressed in developing seeds ［J] . BMC Plant Biology, 2010, 10：183-198.

［14] 陳勝勇, 李觀康, 汪云, 等.谷氨酰胺合成酶的研究進展［J] .中國農學通報, 2010, 26（22）：45-49.

［15] 濮培民.改善太湖馬山水廠水源區(qū)水質的物理-生態(tài)工程實驗研究［J] .湖泊科學, 1993, 5（2）：171-180.

［16] 竇鴻身, 蹼培民, 張圣照, 等.太湖開闊水域鳳眼蓮的放養(yǎng)實驗［J] . 植物資源與環(huán)境, 1995, 4（1）：54-60.

［17] 孫文浩, 俞子文, 余叔文.城市富營養(yǎng)化水域的生物治理和風眼蓮抑制藻類生長的機理［J] .環(huán)境科學學報, 1989, 9（2）：187-195.

［18] 蔣艾青.鳳眼蓮對城郊污水魚塘的凈化試驗［J] .淡水漁業(yè),2003, 33（5）：43-44.

［19] 袁桂良, 劉鷹.鳳眼蓮對集約化甲魚養(yǎng)殖污水的靜態(tài)凈化研究［J] .農業(yè)環(huán)境保護, 2001, 20（5）：322-325.

［20] Casabianca LM. Large production ofEichhornia crassipesof paper industry effluent ［J] . Bioresoure Technol, 1995, 54：35-38.

［21] 袁蓉, 劉建武, 成旦紅, 等.鳳眼蓮對多環(huán)芳烴（萘）有機廢水的凈化［J] .上海大學學報：自然科學版, 2004, 10（3）：272-276.

［22] 賀麗虹, 沈頌東.水葫蘆對水體中氮磷的清除作用［J] .淡水漁業(yè), 2005, 35（3）：7-9.

［23] 宋偉, 韓士群, 劉海琴, 等.水葫蘆去除污水中氮磷的效果［J] .安徽農業(yè)科學, 2008, 36（25）：1107-11079.

［24] Paula MM, Lígia ML, Isabel MS, et al. Expression of the plastidlocated glutamine synthetase ofMedicago truncatulaaccumulation of the precursor in root nodules reveals anin vivocontrol at the level of protein import into plastids ［J] . Plant Physiol, 2003, 132（1）：390-399.

［25] Llorca O, Betti M, González JM, et al. The three-dimensional structure of an eukaryotic glutamine synthetase：Functional implications of its oligomeric structure ［J] . J Struct Biol, 2006,156：469-479.

［26] Sakamoto A, Ogawa M, Masumura T, et al. Three cDNA sequences coding for glutamine synthetase polypeptides inOryza sativaL. ［J].Plant Molecular Biology, 1989, 13：611-614.

［27] Ochs G, Schock G, Trischler M, et al. Complexity and expression of the glutamine synthetase multigene family in the amphidiploid cropBrassica napus［J] . Plant Molecular Biology, 1999, 39：395-405.

［28] Rana NK, Mohanpuria P, Yadav SK. Cloning and characterization of a cytosolic glutamine synthetase fromCamellia sinensis（L.）O. Kuntzethat is upregulated by ABA, SA, and H2O2［J] . Mol Biotechnol, 2008, 39：49-56.

［29] 王小純, 張同勛, 李高飛, 等.小麥谷氨酰胺合成酶基因克隆與其表達特性分析［J] .河南農業(yè)大學學報, 2012, 46（5）：487-492.

［30] 王江, 張景六.稻屬谷氨酰胺合成酶家族的系統分析［J] .植物生理學通訊, 2007, 43（2）：277-282.