內蒙古白絨山羊翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）基因克隆及組織表達特性分析

楊立敏 姚睿原 郭志新 朝格圖 其布日 鄭旭 鮑文蕾 王志鋼

（內蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021）

翻譯控制腫瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein，TCTP）也稱為組胺釋放因子（HRF），包括P21、P23、TPT-1和Q23，存在于許多真核生物中，是由172個氨基酸組成的親水性蛋白質［1]，不包含任何疏水性跨膜結構域或細胞器的定位信號［2]，主要存在于細胞質中［3]，具有進化上的高度保守性。TCTP在許多組織和各類型的細胞中廣泛表達［4]，在細胞代謝及各類生物體維持正常功能過程中起著至關重要的作用，包括調節細胞周期的進程［5]，抗細胞凋亡［6]，蛋白質合成［7]，參與調節炎癥反應、應激反應、細胞生長增殖和分化，癌癥發生［8，9]等。

Rheb（Ras homolog enriched in brain）是Ras超家族的一員，是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路中的上游調節因子，具有整合營養和促細胞分裂信號的功能。細胞內Rheb以兩種狀態存在，即與GTP結合的活性狀態和與GDP結合的無活性狀態，Rheb-GTP形式可以激活下游的mTOR信號通路調節細胞的生理活動。有報道認為，TCTP是調控Rheb的鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factor，GEF），可以使得Rheb結合GTP而有活性。果蠅中TCTP低表達可導致果蠅的細胞、器官變小，細胞數量減少，即出現Rheb突變表型［10]，TCTP直接與Rheb相互作用完成鳥苷酸交換活動，人類的TCTP也有類似的功能［11]。但也有報道指出，在體外實時熒光分析試驗中卻沒有發現hTCTP具有GEF活性，RNA干擾低表達TCTP對S6K磷酸化水平也沒有顯著改變［12]；Wang等［13]發現超表達hTCTP對HEK293細胞的S6磷酸化水平沒有顯著影響。TCTP作為Rheb的鳥苷酸交換因子受到了爭議，其中的關鍵問題是TCTP是否可以與Rheb具有相互作用關系。

我們之前的工作已經克隆了內蒙古白絨山羊的Rheb基因，但TCTP基因及其編碼的蛋白尚未有相關研究報道。本研究試圖建立有效克隆內蒙古白絨山羊TCTP基因的RT-PCR體系，克隆該基因的編碼區cDNA片段，為進一步通過酵母雙雜交方法確定與Rheb的相互作用關系提供條件；同時建立定量RT-PCR 體系，分析TCTP基因的基本表達模式，為進一步研究該基因產物在介導營養信號調控細胞生長及機體發育中的作用提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 內蒙古白絨山羊器官組織采自內蒙古鄂托克旗白絨山羊商業屠宰場屠宰后的羊體。

1.1.2 試劑 總RNA 提取試劑盒（RNAiso Reagent），RNase Inhibitor，RNase Free dH2O，克隆載體pMD19-T Vector，T4 DNA 連接酶、限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ，DNA分子量標準DL2000、λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker，2×SYBR Premix EXTaqTMⅡ試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；反轉錄試劑盒（M-MLV First Strand Kit）購自上海英駿生物技術有限公司（Invitrogen），氨芐青霉素、胰蛋白酶（Trypsin）、標準胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）購自Sigma 公司；質粒提取試劑盒（Biospin Plasmid DNA Extraction Kit）購自博日科技有限公司（BIOER），凝膠回收試劑盒（AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit 50-prep）購自愛思進生物技術（杭州）有限公司（AXYJEN）；DMEM /F12培養基、PBS為Gibco 產品；感受態大腸桿菌DH5α 由本實驗室制備。其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物組織及細胞培養 內蒙古白絨山羊的腎臟、肌肉、胰腺、肝臟、睪丸和腦組織現場采集后立即放入液氮冷凍，帶回實驗室置-80℃保存。胎兒成纖維細胞培養采用單層培養的方法，所用培養基為含有10% FBS的DMEM/F12，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。

1.2.2 總RNA 的提取及反轉錄 按總RNA提取試劑盒（RNA iso Reagent）說明書的操作方法分別提取內蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞及腎臟、肌肉、胰腺、肝臟、睪丸和腦組織的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA 完整性，保存于-80℃備用。用Oligo（dT）20Primers按照反轉錄酶M-MLV說明書的方法反轉錄合成cDNA第一鏈。以胎兒成纖維細胞提取總RNA合成cDNA（cDNA1）為模板PCR 擴增TCTP基因編碼區片段。以腎臟、肌肉、胰腺、肝臟、睪丸和腦組織提取總RNA合成cDNA（cDNA2）為模板，RT-PCR檢測TCTP基因在各組織中的表達情況。

1.2.3 內蒙古白絨山羊TCTP基因的分子克隆 根據GenBank中牛（BT021036.1）和綿羊（EU370543.1）TCTP 基因核苷酸序列，設計PCR 特異性簡并引物P1（表1），以反轉錄合成的cDNA1為模板進行PCR擴增，PCR擴增的反應為10 μL體系：模板cDNA 1 μL；P1（10 μmol/L）0.4 μL；P2（10 μmol/L）0.4 μL；d3H2O 3.2 μL；Trans Mix HiFi 5 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，30 個循環；72℃ 10 min。預期片段長度519 bp。PCR 反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收特異條帶。回收產物與pMD19-T 載體連接，轉化E. coliDH5α感受態細胞，接種于含Amp+的LB培養基，37℃培養14 h，篩選重組菌落，提取質粒，質粒經電泳、PCR和酶切（EcoRI/SalI）鑒定正確后送華大基因有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 測序得到的內蒙古白絨山羊TCTP基因cDNA 序列用NCBI的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行序列比對，開放閱讀框（ORF）預測采用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），理論分子量大小和蛋白等電點預測采用軟件（http：//isoelectric.ovh.org/），預測蛋白質二級結構利用Swiss-Model workspace（http：//swissmodel.expasy.org/）［14-16]，蛋白質功能位點分析采用Psite程序（http：//www.softberry.com），進化樹建立使用CLC軟件，蛋白質亞細胞定位采用ProtComp Version 9.0程序（http：//linux1.softberry.com/）。

1.2.5 組織特異性表達檢測 根據TCTP基因的CDS區序列設計定量PCR引物P2（表1），預期片段長度為169 bp。選用2×SYBR Premix EXTaqTMⅡ試劑盒在羅氏實時定量PCR儀對各組織TCTP基因mRNA豐度進行定量檢測。不同組織的TCTP基因mRNA拷貝數使用β-actin作為內參進行校正，根據β-actin基因序列設計定量PCR引物P3（表1），預期片段長度 229 bp。采用20 μL反應體系，其中包括2 μL cDNA模板，10 μL 2×SYBR Premix EXTaqTMⅡ，0.8 μL引物，6.4 μL dH2O。每個樣本設3個重復，分別使用 P2和P3進行擴增。優化后的退火溫度為48℃，產物特異性使用熔解曲線判定。每個組織的TCTP基因mRNA相對表達量，使用2-DCt表示，其中DCt = Cttargetgene- Ctβ-actin。

表1 本研究中用到的各引物基本信息

2 結果

2.1 TCTP基因克隆與序列測定

PCR 擴增產物經電泳鑒定后得到與預期片段大小相符的特異性條帶（圖1）。重組質粒（pMD19-TTCTP）經PCR和酶切雙重鑒定正確（圖2）。測序結果表明，擴增片段全長519 bp，包括了全部的ORF。

圖1 PCR 擴增產物TCTP的電泳鑒定

圖2 重組質粒pMD19-T-TCTP的酶切鑒定

2.2 TCTP基因序列分析及同源性比較

測序得到的內蒙古白絨山羊TCTP基因cDNA核酸序列中G+C含量為65.55%（圖3）。核苷酸序列與綿羊（NM-001280680.1）、牛（BT021036.1）、豬（NM-214373.1）、人（X16064.1）、猴（XM-0010-90279.2）及大鼠（NM-053867.1）的同源性分別為99%、99%、97%、97%、95%和95%，相應的氨基酸序列同源性均達到99%以上。與已報道的7個物種的TCTP基因核苷酸序列構建進化樹（圖4），表明內蒙古白絨山羊與綿羊和牛的親緣關系較近。

圖3 內蒙古白絨山羊TCTP基因cDNA核苷酸序列及預測氨基酸序列

圖4 根據TCTP基因核苷酸序列構建的進化樹

2.3 編碼蛋白分析

內蒙古白絨山羊TCTP基因編碼一個由172個氨基酸殘基組成的蛋白質。該蛋白理論分子質量19.6 kD，等電點（pI）4.673，氨基酸組成中Glu含量最高，為11%。利用Swiss-Model workspace預測蛋白質二級結構獲得3D圖像（圖5），Psite分析（圖6）表明在51-54氨基酸位有一個N端糖基化位點，在98-100氨基酸位有一個蛋白激酶C磷酸化位點，有3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點分別在9-12氨基酸位、37-40氨基酸位、68-71氨基酸位，48-63氨基酸是翻譯控制腫瘤蛋白特征序列1，134-153氨基酸是翻譯控制腫瘤蛋白特征序列2。ProtComp Version 9.0程序分析將其定位于細胞質中。

圖5 TCTP蛋白3D圖（1-172氨基酸序列）

圖6 內蒙古白絨山羊TCTP氨基酸序列與其他物種氨基酸序列比較及Psite活性位點分析

2.4 組織表達特異性分析

組織定量RT-PCR分析（圖7）表明，TCTP基因在絨山羊腎臟、肌肉、胰腺、肝臟、睪丸和腦組織中均有表達，其中在肝臟中的表達量較高，在腦中表達量較低。

3 討論

圖7 定量RT-PCR檢測內蒙古白絨山羊TCTP基因組織表達特異性

翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）是一種高度保守的蛋白，存在于真核生物中，本試驗克隆得到的內蒙古白絨山羊TCTP基因編碼區序列全長519 bp，與已報道的幾種哺乳動物的序列長度相同且比對顯示同源性較高，Psite程序分析顯示克隆得到的TCTP基因含有TCTP特征序列1和TCTP特征序列2，表明克隆的內蒙古白絨山羊TCTP基因正確。

TCTP在真核生物中廣泛表達，過去的研究已發現在500多個不同的組織和細胞類型中均存在，但依據組織和細胞類型及其不同的生長階段，表達水平差別極大，在有絲分裂活躍的組織中表達量相對較高，在有絲分裂期后的組織中表達量相對較低［17，18]。Fiucci等［19]研究發現TCTP在小鼠多個組織中均有表達，并且在腦中表達量最低，在肝臟和腎臟中表達量最高。本研究定量RT-PCR檢測結果表明，TCTP基因在內蒙古白絨山羊腎臟、肌肉、胰腺、肝臟、睪丸和腦中均有表達，表達量在肝臟中較高，在腦中較低，與小鼠中的表達模式基本一致，表明TCTP在結構與功能上的高度保守性。

雖然TCTP缺乏核雙向定位信號序列，但其作為一種抗氧化蛋白［20]在細胞質和細胞核中均有分布［21，22]。TCTP蛋白通常具有公認的小泛素樣（SUMO化）修飾，這種修飾可能在其核運輸中起著非常重要的作用［23]。細胞內一些蛋白與TCTP蛋白在結構和功能上密切相關，TCTP保守的β-折疊區域對它與其它分子間的相互作用非常重要，如與Bcl-XL結合可以完成抗凋亡活動［24]；α-螺旋區域與Ca2+［25，26]和微管蛋白結合［27，28]，對鈣傳輸和進一步的信號轉導起著重要作用。作為一種管家基因，除了GEF的作用，TCTP在許多細胞生理中發揮功能。

內蒙古白絨山羊是經過長期自然選育形成的優良地方性絨肉兼用型品種，對營養的需求、利用與代謝有其特殊性，機體對營養和能量信號刺激的敏感性在絨肉發育中起著重要的作用，但機制尚不清楚。mTOR信號通路是細胞內介導營養信號調控細胞生長與代謝的中心協調器，如能確定TCTP通過與Rheb的直接作用而實現其GEF功能，則能確定TCTP對mTOR信號通路的調控作用。本研究正確克隆了內蒙古白絨山羊TCTP基因并對其基本表達模式進行了分析，這些結果將為進一步研究TCTP在絨山羊細胞生長和早期胚胎發育中的功能及發揮作用的分子機制提供條件。

4 結論

克隆的內蒙古白絨山羊TCTP基因cDNA序列為519 bp，包含了全長ORF。TCTP基因在腎臟、肌肉、胰腺、肝臟、睪丸和腦組織中均有表達，其中在肝臟中的表達量最高，在腦中表達量最低。TCTP基因的克隆為下一步研究其與Rheb之間的相互作用提供了條件。

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