吉富羅非魚源無乳鏈球菌Sip-GAPDH融合基因的構建及其原核表達

王蓓 李桂歡 魯義善 湯菊芬 黃郁蔥吳灶和 簡紀常

（1.廣東海洋大學 水產學院，湛江 524088；2.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088；3.廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088；4.仲愷農業工程學院，廣州 510225）

羅非魚，又被稱為“白色三文魚”，是聯合國糧農組織推薦的21世紀最有發展前景的淡水養殖品種［1，2]。然而隨著高密度養殖和環境日益惡化，病害日趨嚴重，造成的損失逐年增加。從2009年至今，羅非魚鏈球菌病在我國羅非魚多個主養地區泛濫，發病及死亡率高，并由傳統的高溫時節發病演變為趨向于全年大部分時間均可發生，發病率和死亡率直線上升（部分地區可高達90%）［3]。

為了預防羅非魚鏈球菌病，人們不斷地對鏈球菌病疫苗進行研究和探索。隨著分子生物學的發展，通過人工合成或重疊延伸等方法可將幾個不同的基因片段相互拼接起來，構成不同蛋白質的融合體，同時展現不同來源蛋白質的活性和功能，甚至可以獲得協同效應［4]。表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein，Sip）是B群鏈球菌（Group BStreptococcus，GBS）的一種表面蛋白，在GBS 多種血清型的菌株中均有表達，目前該蛋白已在人、小鼠、奶牛及羅非魚中證實了其具有良好的免疫原性［5-7]。病原微生物中的某些生理代謝作用酶在近年來被作為疫苗和藥物的研究靶分子對象［8]，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）便是糖酵解過程中的一種關鍵代謝酶，在多種病原體中已經進行了其作為保護性抗原的研究并取得了良好的效果［9，10]。

本研究利用重疊延伸PCR技術將羅非魚源無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）Sip基因和GAPDH基因通過特定的Linker序列進行連接，構建無乳鏈球菌Sip-GAPDH融合基因的原核表達質粒，旨在為研制具有良好保護率的鏈球菌亞單位疫苗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 羅非魚源無乳鏈球菌（S. agalactiae）強毒株ZQ0910由本實驗室分離保存。

1.1.2 試劑 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）與pET-32a（+）均由本實驗室保存。克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司（日本）。表達載體pET-32（a）購自Novagen公司（德國）。限制性內切酶BamH I、SalI、T4 DNA連接酶和Prime STARTMHS DNA polymerase均購自TaKaRa公司（日本）。小鼠抗His-Tag單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠IgG和顯色底物DAB均為Invitrogen產品（美國）。細菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產品（中國）。HisTrap HP為GE公司產品（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA的提取及Sip、GAPDH基因的擴增 按照天根生化科技（北京）有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取無乳鏈球菌（S.agalactiae）基因組DNA，根據GenBank上已登錄的Sip、GAPDH基因序列（EIM 69670.1、EIM71266.1）設計特異性引物S1/S2和G1/G2，分別引入酶切位點BamH I與SalI，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。反應條件為：94℃預變性4 min；94℃ 30 s，60℃/57℃（Sip/GAPDH）30 s，72℃ 90 s，共34個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后切膠回收，然后克隆入pMD18-T載體，菌落PCR鑒定后將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 Sip、GAPDH基因的擴增引物

1.2.2 引物設計及基因擴增 根據測序所得到的Sip，GAPDH基因序列，應用Primer5.0軟件，設計兩對引物P1/P2、P3/P4分別用于擴增準備進行融合的基因，該引物中引入了柔韌性較好的（Gly4Ser）3氨基酸多肽作為linker序列（表2斜體部分）鏈接兩個基因，并在P1/P4引物中分別引入酶切位點BamH I與SalI，由生工生物工程（上海）股份有限公司（表2）。以pMD18-Sip和pMD18-GAPHD質粒為模板，采用引物P1/P2，P3/P4分別擴增Sip和GAPDH基因。PCR體系為：模板2 μL，上下游引物各 1 μL，dNTP Mixture 4 μL，Prime STARTmHS DNA polymerase 0.5 μL，5×Prime STARTMBuffer（Mg+plus）10 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR反應條件同1.2.1。

1.2.3Sip與GAPDH基因融合 取Sip與GAPDH回收產物各2 μL混合作為模板，PCR體系為：Sip+GAPDH2 μL+2 μL，10×LA Buffer 5 μL，LA酶1 μL，dNTP Mixture 4 μL，ddH2O 33 μL。PCR反應條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 3 min，10個循環；最后向PCR管中補加引物P1、P4和LA酶各1 μL，繼續進行PCR循環25個，然后72℃延伸10 min。反應結束后，取5 μL產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后克隆入pMD18-T載體構建，菌落PCR鑒定后將陽性克隆質粒pMD18-Sip-GAPDH送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表2 Sip-GAPDH融合基因擴增引物

1.2.4 融合基因的原核表達載體構建 將pMD18-Sip-GAPDH質粒和pET-32a（+）質粒分別采用限制性內切酶BamH I和SalI雙酶切，用T4連接酶連接過夜，轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含Amp＋（100 μg/mL）的LB平板，挑取單個菌落，接種于1mL LB培養基中，37℃振蕩培養過夜。PCR菌落及測序鑒定正確后，抽提質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，再進行PCR菌落和測序檢測。將測序結果正確的菌株液以1∶100的比例接種于含Amp＋（100 μg/mL）的LB培養基中，37℃振蕩培養至OD600為0.4-0.6，加IPTG誘導表達。

1.2.5 誘導表達條件的優化 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的濃度分別為0.02、0.06、0.1、0.4、0.7和1.0 mmol/L，誘導時間為0、1、2、3、4和5 h，誘導溫度為28℃和37℃，采用解離非連續緩沖系統垂直板電泳，丙烯酰胺濃度：分離膠12%（V/V），濃縮膠5%（V/V）。每孔上樣6 μL，濃縮膠以70V電壓跑約20 min，分離膠以140V電壓跑約2 h，然后染色、脫色。

1.2.6 目的蛋白純化和濃度測定及免疫印跡分析 將目的蛋白按最優條件誘導表達后，超聲破碎提取融合蛋白，利用HisTrap HP親和柱純化融合蛋白，上樣細胞裂解液后用不同濃度的咪唑洗脫緩沖液洗柱，得到純化蛋白，隨后將收集到的目的蛋白進行SDS-PAGE分析并進行蛋白濃度測定。純化的融合蛋白經SDS-PAGE電泳后轉至NC膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，加入一抗（鼠抗His單克隆抗體，1∶2 000稀釋）孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；然后，加入二抗（HRP標記的羊抗鼠IgG，1∶500稀釋）孵育1 h，再用TBST清洗3次，每次10 min；最后加入DAB顯色液，待出現明顯條帶后用水終止反應。

2 結果

2.1 Sip、GAPDH基因的擴增

PCR擴增后分別得到1 305 bp和1 011 bp的兩條特異性條帶（圖1），克隆入pMD18-T載體，菌落PCR、酶切鑒定正確后測序分析，結果表明，Sip基因含有一個1 305 bp的的開放閱讀框（ORF），編碼434個氨基酸，預測分子量約為45.6 kD，等電點為6.72，其在GenBank上的登錄號為EIM69670.1。GAPDH基因含有一個1 011 bp的開放閱讀框（ORF），編碼336個氨基酸，預測分子量約為36.01 kD，等電點為5.17，在GenBank上的登錄號為EIM71266.1。

圖1 Sip基因（A）和GAPDH基因（B）的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 Sip-GAPDH融合基因的擴增

通過重疊延伸基因拼接擴增機制擴增出一條長度為2 358 bp的特異性條帶，與預期相符，表明已將Sip、GAPDH基因已實現了融合（圖2）。

圖2 Sip-GAPDH基因的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 融合基因原核表達重組質粒的構建

將pET-32a（+）質粒與pMD18-Sip-GAPDH質粒經雙酶切后連接，構建的原核表達重組質粒命名為pET-32a-Sip-GAPDH。經雙酶切鑒定后表明已在pET-32a（+）質粒中插入了一段2 358 bp的序列（圖3），結合測序結果確定該原核表達載體構建成功。

圖3 重組質粒pET-32-Sip-GAPDH質粒雙酶切鑒定

2.4 重組質粒的誘導表達、純化及Western blot分析

將pET-32a-Sip-GAPDH質粒轉化入大腸桿菌BL21（DE3），經優化條件（0.1 mmol/L IPTG，5 h，37℃）誘導后可以表達分子量為102.01 kD左右的融合蛋白（圖4，泳道A7、泳道B6、泳道C6），其中Sip-GAPDH的預計分子量為81.61 kD；pET-32a的預計分子量為20.4 kD。未經誘導的含重組質粒pET-32a-Sip-GAPDH的菌體作為陰性對照，誘導后的蛋白電泳帶與對照組相比，在102.01 kD處有相應條帶（圖4）。Western blot（圖5）證實pET-32a-Sip-GAPDH重組融合蛋白條帶大小與預測結果相一致，說明表達產物能與抗體特異性結合，證實了該蛋白成功表達。

圖4 pET-32a-Sip-GAPDH在IPTG濃度（A）、誘導時間（B）和誘導溫度（C）表達情況的SDS-PAGE分析

圖5 Sip-GAPDH蛋白的Western blot分析

3 討論

由無乳鏈球菌引起的羅非魚鏈球菌病給我國羅非魚養殖業造成了巨大的經濟損失［11]，而現階段缺乏對羅非魚源無乳鏈球菌有效的治療藥物，采用疫苗免疫的策略防控魚類鏈球菌病是最有效的途徑。尋找有效的疫苗靶蛋白是研制高效漁用疫苗的關鍵。3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）是一種分布在細胞質中，在糖酵解過程中起關鍵作用的酶，近年來的研究表明，GAPDH是一種多功能蛋白，參與多種細胞功能的修復及調控［12]。此外，病原體接觸到宿主時，GAPDH可以憑借自身的抗氧化功能改變病原體所處的外界環境，減少宿主對病原體產生的氧化毒性作用。因此，GAPDH作為研究疫苗和藥物的重要靶分子，引起了業內的關注，目前科學家們已在多種病原生物中進行該基因的免疫原性的研究，并證實了其可作為疫苗候選分子的可能性［13-15]。表面免疫相關蛋白（Sip）是Brodeur等［16]采用免疫學篩選方法從基因庫中鑒定出的一種具有高度保護性的蛋白，黎炯等［17]將其應用到免疫吉富羅非魚中獲得了79%-82.6%的保護率。嵌合疫苗是在基因水平上改造病原體，將兩種或多種病原體的基因片段用基因工程的方法以不同形式連接或置換，構建一個能表達兩種或多種病原體抗原物質的重組基因，然后采用傳統方法制備疫苗［18]。近年來此類疫苗的應用范圍逐漸擴大，大量的動物試驗證明，嵌合疫苗能夠增強動物對外來抗原免疫應答反應，具有樂觀的應用前景。因此本研究選取了無乳鏈球菌ZQ0910株中高度保守的Sip與GAPDH基因，成功的通過重疊延伸拼接技術構建了Sip-GAPDH融合基因，并進行原核表達，這為探索該融合基因的免疫原性提供有力的理論依據。

重疊延伸PCR技術（SOEing PCR）是采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成重疊鏈，并能在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術。該技術的關鍵是重疊互補引物的設計，Link序列的組成對結構穩定起著關鍵作用，一般選擇氨基酸個數在10-15個堿基，因為Linker序列過長，會在擴增過程中使融合蛋白對蛋白酶敏感，導致產量下降。甘氨酸（Gly）由于分子量小，沒有手性碳，是柔性較好的氨基酸，絲氨酸（Ser）是所有氨基酸中親水性最強的氨基酸，因此本研究中選擇大多數沿用的（Gly4Ser）3作為Linker序列［19]，鄭黎燕等［20]將帶有Linker序列與不帶Linker序列的融合蛋白進行了比較發現，接頭Linker序列對融合蛋白的生物活性沒有影響，這為下一步的工作提供了理論支持。此外，為了保證嵌合序列的正確性，有效地校正擴增產物末端的錯配堿基，本試驗中采用了既具有一般Taq酶5'-3'聚合酶活性，又具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶來進行擴增，通過測序及后續的表達結果均能證明擴增序列正確性。

pET原核表達載體是有史以來在大腸桿菌中表達重組蛋白功能最強大的系統之一，一旦條件適合，目的蛋白只需誘導幾小時，即可表達出占細胞總蛋白量一半以上。利用大腸桿菌表達重組蛋白存在包涵體表達和可溶性表達兩種形式，重組蛋白存在于上清中有利于蛋白純化且大都具有活性。本研究選用表達宿主菌BL21（DE3）和表達載體pET-32a（+），構建無乳鏈球菌Sip-GAPDH原核蛋白表達系統，通過IPTG誘導及Western blot分析發現表達產物穩定，相對分子質量與預期相符，說明該原核表達系統構建成功。此外，本試驗中通過表達得到屬可溶性表達的蛋白，為后續試驗奠定了良好的基礎。

外源蛋白的表達與多種因素有關，如載體、宿主、外源基因及誘導條件。誘導劑、誘導時間及誘導溫度是能直接影響蛋白表達的3種關鍵因子。因此，本試驗為獲得最優的表達效率，采用了固定其他因子，對單個因子進行不同溫度、不同IPTG濃度和不同誘導時間表達后，獲得了一個最優化的表達體系。本試驗中，IPTG濃度為0.1 mmol/L時，蛋白表達量達到最大，隨著IPTG濃度的增加表達量并沒有增加，考慮到高濃度的IPTG對大腸桿菌的生長繁殖會有毒性作用，所以選擇0.1 mmol/L作為最適誘導濃度。誘導時間不同也會導致表達量的差異，本研究中，當誘導時間再5 h以下時，目的蛋白表達量會隨著時間延長而增加，并達到一定的濃度，因此選擇了5 h作為最佳誘導時間。此外，本試驗中37℃的誘導表達量明顯高于其他溫度，推測可能與大腸桿菌在37℃時體內酶的活性最大以及T7啟動子活性最強有關。通過最佳誘導條件的表達可以得到大量的Sip-GAPDH融合蛋白，該體系的構建為后續需要大量制備蛋白提供了理論基礎。此外，免疫印跡實驗結果表明，純化的目的蛋白與鼠抗His-tag單克隆抗體能產生反應，這也從另一個角度佐證了該蛋白的成功表達。

4 結論

本研究采用重疊延伸PCR技術將羅非魚源無乳鏈球菌Sip基因和GAPDH基因通過特定的Linker序列進行連接，成功地構建了無乳鏈球菌Sip-GAPDH融合基因的原核表達載體。

［1] 儲霞玲, 曹俊明, 白 雪娜, 等. 2011年廣東羅非魚產業發展現狀分析［J] .廣東農業科學, 2012（8）：12-14.

［2] 雷光英, 曹俊明, 萬忠, 等. 2008年度廣東省羅非魚產業發展現狀分析［J] .廣東農業科學, 2009（7）：240-243.

［3] 林慶強.羅非魚的鏈球菌病防治［J] .科學養魚, 2010（11）：56.

［4] 章輝, 朱蔭昌, 司進, 等.日本血吸蟲復合B細胞表位抗原的制備和鑒定［J] .中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2007, 25（4）：285-289.

［5] Rioux S, Martin D, Ackermann HW, et al. Localization of surface immunogenic protein on group B streptococcus［J] . Infection and Immunity, 2001, 69（8）：5162-5165.

［6] Manning SD, Wood S, Kasha K, et al. Naturally occurring antibodies for the group B streptococcal surface immunogenic protein（Sip）in pregnant women and newborn babies［J] . Vaccine, 2006, 24（47）：6905-6912.

［7] 布日額, 郎景民, 劉娣, 等.奶牛無乳鏈球菌內蒙古分離株SIP基因的克隆與序列分析［J] .黑龍江畜牧獸醫, 2009, 9：71-72.

［8] 張詠莉, 吳德, 余新炳.華支睪吸蟲3-磷酸甘油醛脫氫酶重組蛋白的純化、酶學活性及免疫學研究［J] .中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2005, 23（4）：231-235.

［9] Hannaert V, Oppendoes FR, Michels PA. Glycosomal glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase ofTrypanosoma bruceiandTrypanosoma cruziexpression inEscherichia coli, purification and characterization of the enzyme［J] . Protein Expression and Purification,1995, 6：244-250.

［10] Hannaert V, Blaauw M, Kohl L, et al. Molecular analysis of the cytosolic and glycosomal glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase inLeishmania mexicana［J] . Molecular and Biochemical Parasitology, 1992, 55（1-2）：115-126.

［11] 張新艷, 樊海平, 鐘全福, 等.羅非魚無乳鏈球菌的分離, 鑒定及致病性研究［J] .水產學報, 2008, 32（5）：772-779.

［12] 尚海旭, 井然, 賈弘禔, 等. GAPDH功能多樣性［J] .生理科學進展, 2011, 42（5）：371-374.

［13] Yang HW, Yong TS, Lee JH, et al. Characterization of two glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase genes inGiardia lamblia［J] . Parasitology Research, 2002, 88：646-650.

［14] Shin GW, Palaksha KJ, Kim YR, et al. Immunoproteomic analysis of capsulate and non-capsulate strains ofLactococcus garvieas［J] . Veterinary Microbiology, 2007, 119（2-4）：205-212.

［15] Rayyan W, Kuntz DA, Opperdoes FR, et al. 1992. Expression inBacillus subtilisof the glycosomal glyceraldehydes phosphate dehydrogenase gene fromTrypanosoma brucei［J] . Biochimie,1992, 74（2）：137-141.

［16] Brodeur BR, Boyer M, Charlebois I, et al. Identification of group B streptococcal Sip protein, which elicits cross-protective immunity［J] . Infection and Immunity, 2000, 68（10）：5610-5618.

［17] 黎炯, 葉星, 可小麗, 等.羅非魚無乳鏈球菌Sip基因的克隆,表達及免疫原性分析［J] .水生生物學報, 2012, 36（4）：626-633.

［18] 莊敏, 李迪, 谷鴻喜.病毒嵌合疫苗的研究進展［J] .國外醫學免疫學分冊, 2004, 27（3）：137-141.

［19] 劉巖, 于漣.基因融合技術及其應用［J] .農業生物技術學報,2006, 14（2）：127-132.

［20] 鄭黎燕, 奚永志, 孔繁華, 等.重組人IL-6D24-PE40外毒素融合蛋白的構建及其生物學效應［J] .中華微生物學和免疫學雜志, 2001, 21（1）：95-98.