香魚巨噬細胞炎性蛋白-2基因的克隆、序列分析及表達

王世會 史雨紅 陳炯

（寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室，寧波 315211）

趨化因子（Chemokines，CK）是一類能使細胞發生趨化運動的小分子細胞因子，從1986年發現第一個趨化因子至今，至少已經發現了60種趨化因子。其中趨化因子家族成員巨噬細胞炎性蛋白（Macrophage inflammatory protein，MIP）是由Wolpe等［1]于1988年首次發現的。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激鼠巨噬細胞系RAW264.7后，用肝素親和柱分離出了兩種新的蛋白質MIP-1和MIP-2。這兩種蛋白質分別占巨噬細胞分泌蛋白質的5%和2%［1，2]。通過這種方法他們所獲得的MIP-2是一分子量6 kD、成熟蛋白含有73個氨基酸殘基的堿性蛋白［3]。MIP-2具有重要的生理作用，可以特異性地趨化中性粒細胞到炎癥部位，從而消除炎癥反應。Lentsch等［4]提到，小鼠由于局部出血而引起肝組織損傷中，MIP-2蛋白可以特異性地驅動白細胞到達炎癥部位，消除炎癥反應。同時在病毒性侵染導致的免疫應答反應中，病毒可以引起趨化因子MIP-2蛋白的表達量上調，影響免疫細胞殺傷病毒的能力，提高寄主對病毒的抗性［5]。小鼠在注射接種柯薩奇B3病毒（CVB3）14 d后，心肌組織MIP-2基因mRNA表達量顯著上調［6]。除了具有趨化作用外，在造血調控中MIP-2也發揮著作用。Broxmeyer等［7，8]認為MIP-2起到與其它造血因子協同或影響的作用。目前，關于MIP-2的文獻報道以人和鼠為主，而魚類MIP-2基因只能從數據庫中檢索到相關序列，暫無相關文獻報道。

香魚（Plecoglossus altivelis，Sweetfish）隸屬胡瓜魚目香魚科，是東亞地區中國、日本和朝鮮等國家特有的一種小型經濟名貴魚類［9]。近年來在中國的養殖面積日益增加，但病害問題嚴重。其中鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）是養殖香魚的主要病原菌之一，對香魚養殖業造成巨大的經濟損失［10]。與直接使用化學試劑防治病害相比，免疫學方法對魚體和食用者更安全，對環境更環保。因此，本研究對香魚MIP-2基因進行序列分析，分析其mRNA表達與鰻利斯頓氏菌感染相關性；采用原核表達獲得香魚MIP-2蛋白，制備香魚MIP-2抗血清，旨為進一步深入研究香魚MIP-2蛋白功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康香魚購自寧海鳧溪香魚養殖場；ICR小鼠購自寧波大學實驗動物中心；鰻利斯頓氏菌香魚分離株sweetfish-H080701、大腸桿菌Top10和BL21 pLys E菌株、原核表達載體pGEX-3X等由本實驗室提供；RNAiso試劑、SYBRPremix Ex Taq試劑盒、AMV逆轉錄酶等購自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit購自Omega公司；辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物技術有限公司；ECL化學發光試劑盒、顯影定影試劑盒、柯達X-OMAT BT膠片和壓片暗盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 購回的香魚在實驗室中飼養1周，隨機選取3尾健康香魚，采集心、肝、鰓、腎、腦、脾、肌肉、腸等組織，投入液氮中，隨后轉入超低溫冰箱中保存。剩余的香魚均分為試驗組和對照組，每3尾一組，試驗組每尾腹腔注射100 μL鰻利斯頓氏菌懸液（1.0×105CFU/mL PBS），對照組每尾注射100 μL PBS溶液。分別于注射后4、8、12和24 h取樣，取樣方法同上。

1.2.2 香魚MIP-2基因序列分析 利用巨噬細胞轉錄組測序獲得香魚MIP-2基因序列，采用PCR方法從香魚巨噬細胞cDNA中擴增后測序驗證，經分析所獲得的序列與轉錄組測序結果一致［11]。信號肽序列預測采用SignalP 4.0在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。用MEGA 4.0軟件［12]進行多重序列比對和系統進化樹構建，所需基因序列信息，見表1。

表1 基因、物種、登錄號信息

1.2.3 香魚MIP-2基因mRNA的組織表達特征分析采用RNAiso試劑提取香魚總RNA，隨后用DNase I處理，再以oligo（dT）30為引物合成第一條cDNA鏈。根據MIP-2基因ORF序列設計擴增引物MIP-2-text-F（5'-CAGAGTCCTGATGCTCCTTGC-3'）和MIP-2-text-R（5'-CCAGTCTTATCTTGGGGTCGA-3'），預計擴增片段長度為224 bp。以β-actin基因（AB020884）為內參設計引物，pActin2（+）5'-TCGTGCGTGACATCAAGGAG-3'和pActin2（-）5'-CGCACTTCATGATGCTGTTG-3'，預期擴增片段長度為231 bp。實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測MIP-2基因mRNA在香魚各組織中的表達變化。

1.2.4 與鰻利斯頓氏菌侵染相關的香魚各組織MIP-2基因mRNA的表達變化 取腹腔注射后不同時間的香魚各組織，檢測MIP-2基因mRNA表達量的變化。采用實時熒光定量PCR來研究鰻利斯頓氏菌感染過程中香魚各組織MIP-2基因mRNA轉錄水平的表達變化情況。由程序MxPro 3.2讀取熒光定量結果，結果分析采用相對標準曲線法2-DDCt［13]，獲得香魚各組織MIP-2基因mRNA的相對表達量。試驗結果采用SPSS單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統計，P<0.05為顯著差異。

1.2.5 香魚MIP-2基因的原核表達和抗血清制備 設計原核表達引物pGEX-3X-MIP-2（+）5'-CGCCATGACAACCAGAGTCCTGAT-3'和pGEX-3X-MIP-2（-）5'-GTCAGACTGTGTCTGGAA GCA-3'（下劃線限制性內切酶EcoR I和BamH I的識別序列），以香魚腎組織cDNA為模板，PCR擴增MIP-2基因，預期大小產物（318 bp）經2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠純化。純化產物經連接、轉化、測序驗證等步驟后，用BamH I和EcoR I雙酶切，回收的MIP-2片段插入到同樣雙酶切的pGEX-3X中，獲得重組質粒pGEX-3X-MIP-2。轉化大腸桿菌BL21 pLys E后IPTG （終濃度0.4 mmol/L）誘導，SDS-PAGE檢測。預期大小的蛋白切膠純化后免疫小鼠，制備抗血清［9]。

1.2.6 蛋白質印跡 12% SDS-PAGE分離膠中分離蛋白，采用濕轉法轉PVDF膜。轉膜結束后用封閉液（含5%脫脂奶粉配制的PBST緩沖液），37℃封閉2 h。一抗（MIP-2小鼠抗血清）4℃孵育過夜，PVDF膜用PBST緩沖液清洗，每次10 min，共3次。隨后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h。再用PBST清洗，每次10 min，共3次。加上ECL于暗室顯影。

2 結果

2.1 香魚MIP-2基因cDNA序列分析

MIP-2基因開放閱讀框的序列長度為318個核苷酸，編碼一個由105個氨基酸組成、相對分子質量為11.6 kD的前體蛋白。用Signal P信號肽預測軟件預測前體蛋白N端19個氨基酸為信號肽序列，信號肽的剪切位點是第19位的谷氨酰胺（Gln），成熟肽MIP-2預測相對分子質量為9.4 kD。通過多重序列比對分析（圖1），可以看到CXC型趨化因子的典型結構區域。

圖1 與MIP-2同源的氨基酸序列多重序列比對

氨基酸序列分析表明，香魚MIP-2與白斑狗魚（Esox lucius）MIP-2同源性最高，達54%。與其它魚類MIP-2的同源性介于39%-41%之間，與哺乳動物MIP-2的同源性低于34%。系統進化樹（圖2）分析揭示，香魚的MIP-2和其它魚類中的MIP-2和IL8、IL-8like比較接近，而和哺乳動物的相關基因則相差較遠。

2.2 香魚MIP-2基因mRNA組織表達特征

圖3結果顯示MIP-2基因mRNA在各組織表達量有差異。健康香魚MIP-2基因mRNA在脾、腎、腦、鰓組織中表達量較高，在肝、心、肌肉和腸中表達量相對較少。

圖2 基于NJ法構建的MIP-2蛋白氨基酸序列系統進化樹

圖3 香魚MIP-2基因mRNA的組織表達特征

2.3 鰻利斯頓氏菌侵染后香魚各組織MIP-2基因mRNA的表達變化

鰻利斯頓氏菌感染香魚后，魚鰭基部出現充血發紅、 肌肉腐爛等典型的細菌敗血癥癥狀，而對照香魚未出現異常現象。由實時熒光定量PCR結果可知，鰻利斯頓氏菌侵染香魚后，各組織中MIP-2基因mRNA出現不同程度表達上調。尤其是在腎組織和肌肉組織中上調最顯著，最高值分別為對照組的23和25倍。此后表達量上調趨緩，趨向恢復到對照組表達水平。而在心、鰓和肝組織中，8 h的表達量分別為對照組的15.5、13和11倍。其它組織脾、腦、腸中也都呈上調趨勢，最高值分別是對照組的5、4.3和6.8倍（圖4）。

2.4 香魚MIP-2基因的原核表達

重組質粒測序驗證后，轉化進入大腸桿菌BL21 pLys E中，經IPTG誘導表達，在12% SDS-PAGE分離膠中觀察到一條約為37 kD的融合蛋白條帶（圖5-A），與預測的MIP-2融合蛋白相對分子質量吻合（37.3 kD）。該蛋白條帶切膠純化后免疫小鼠，制備抗血清。Western blotting檢測抗血清（圖5-B）。

3 討論

系統進化樹分析表明，香魚MIP-2和白斑狗魚的MIP-2同源性最高，同時和其它魚類的IL-8、IL8-like也具有較高的同源性。由于轉錄組測序結果中，我們獲得了與IL8同源性更高的序列，因此，暫將該基因命名為MIP-2，其蛋白特性還需進一步驗證。此外，據相關文獻報道，鼠中的MIP-2和人類的IL8具有很高的同源性［14]，而鼠中的IL8一直未發現，所以有可能鼠中的MIP-2和人類中的IL8發揮著同樣的作用［15]。

本文研究表明，鰻利斯頓氏菌侵染后，香魚各組織中MIP-2基因mRNA表達量均出現顯著上調，說明MIP-2基因mRNA表達變化與鰻利斯頓氏菌侵染香魚的急性反應相關。MIP-2基因mRNA與細菌感染相關性文獻主要集中對哺乳動物小鼠和大鼠的研究，魚類暫無相關報道。大腸桿菌感染小鼠腎組織2 h時，MIP-2基因mRNA的表達上調29倍［16]。Rovai等［17]將LPS注射進入小鼠體內后，小鼠肺、心、肝、脾組織MIP-2基因表達均在感染后2 h出現顯著上調，隨后上調趨勢逐漸放緩。由b型流感嗜血桿菌所引起的小鼠腦膜炎病癥中，Diab等［18]發現MIP-2基因在感染12 h時上調表達，48 h達到峰值，7 d表達量趨近于正常水平。此外，關于MIP-2參與防御細菌感染的分子機制也有報道。在由克雷伯氏細菌引起的小鼠肺炎中，MIP-2蛋白表達顯著上調，同時可調節中性粒細胞抵達肺部清除病菌［19]。大鼠小腸感染病菌后，上皮細胞分泌MIP-2蛋白，調節中性粒細胞進入到小腸以清除病菌［20]。通過對小鼠的研究發現MIP-2發揮免疫功能的機制是趨化中性粒細胞到炎癥部位，從而消除炎癥反應。因此我們推測，香魚MIP-2蛋白可能也具有類似機制，但還需進一步驗證。

原核表達作為最經典、最成熟的蛋白表達系統被廣泛用于分子生物學和基因工程等研究。通過原核表達獲得目的蛋白，制備抗血清，進而采用血清學方法檢測，為進一步深入研究蛋白功能奠定了基礎［21]。因此，本研究通過原核表達獲得香魚MIP-2蛋白，制備香魚MIP-2抗血清，為研究MIP-2在香魚抗菌免疫中的作用奠定了基礎。

圖4 實時熒光定量PCR分析鰻利斯頓氏菌侵染前后香魚各組織MIP-2基因mRNA表達變化

圖5 香魚MIP-2基因的原核表達的分析（A）SDS-PAGE和抗血清（B）的檢測

4 結論

從香魚巨噬細胞轉錄組測序結果中獲得香魚MIP-2基因。序列分析表明，香魚MIP-2具有已知的CXC型趨化因子特征性結構，即含CXC的結構。系統進化樹分析表明，香魚MIP-2和白斑狗魚的MIP-2同源性最高，同時和其它魚類的IL-8、IL8-like也具有較高的同源性。組織表達特征研究揭示，健康香魚MIP-2基因mRNA主要在脾、腎、腦、鰓組織中表達，在肝、心、肌肉、腸組織中表達次之。研究表明，被鰻利斯頓氏菌侵染后，香魚各組織中MIP-2基因mRNA表達量均出現顯著上調，說明MIP-2基因mRNA表達變化與鰻利斯頓氏菌侵染香魚的急性反應相關。

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