虛寒狀態大鼠肝臟能量代謝變化研究*

李連珍，薛春苗，張 冰，劉小青

（1.河南農業大學農學院，鄭州 450002；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；3.北京中醫藥大學中藥學院，北京100029）

在藥性理論研究的過程中，證候模型的塑造和研究至關重要。虛寒狀態動物模型的建立和界定，近年來也進行了大量研究[1-3]。虛寒狀態，臨床又稱為虛寒證或陽虛證，是中醫臨床常見的一種證型，一般認為是體內陽氣虛衰所致，其宏觀癥狀主要有四肢怕冷、身體蜷臥、畏寒、喜溫喜暖等。而“寒”的本義與客觀的溫度相關，陸明等[4-5]也發現虛寒證患者7處溫度與正常人相比差異有統計學意義，并認為虛寒證肢冷患者的肢體溫度降低是由產能不足與儲能不足或生物利用度低下兩方面原因造成的，是一種整體的功能失調，故虛寒證患者可能涉及能量代謝障礙。那么虛寒狀態動物模型的能量代謝又會如何變化？本研究在課題組前期工作的基礎上[6]，選擇氫化潑尼松誘導大鼠虛寒狀態，觀察虛寒狀態下大鼠肝臟能量代謝相關因子變化特點，為虛寒證動物模型的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑 注射用氫化潑尼松琥珀酸鈉（天津生物制藥有限公司生產，每只50 mg，批號：20100310），琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20100720），三磷酸腺苷酶（ATPase）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20100620），偶聯蛋白-2（UCP-2，兔一抗（博士德生物工程有限公司），羊抗兔二抗（博士德生物工程有限公司），DAB（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 儀器 2000UV紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司生產），Centrifuge5415D臺式離心機（德國Eppendorf產品），德國Hei dolph公司DIAX900型內切式勻漿器，BS323S電子天平（德國賽多利斯股份公司），CX4型全自動生化分析儀（美國貝克曼公司），XSP-2C生物顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 動物 雄性SD大鼠，48只，體質量240～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2007-0001。

2 方法

2.1 分組處理 大鼠隨機分為兩組，即正常組和虛寒組，每組各24只。虛寒組每天上午8：00左右，后腿肌肉交替注射氫化潑尼松琥珀酸鈉生理鹽水溶液，20 mg/kg，正常組注射等體積生理鹽水。注射第14、第21天晚上8點，正常組和虛寒組各12只，禁食不禁水12 h，次日上午8點，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主靜脈取血，分離血清，測乳酸（LAC）。固定位置取一塊兒肝臟，4%多聚甲醛固定，每組動物按號間隔取，每組取5個標本，待測免疫組化。其余肝臟，-80℃凍存，待測SDH和ATP酶。

2.2 指標檢測 血清LAC由貝克曼CX4型全自動生化分析儀檢測。肝勻漿中SDH、ATP酶活性，按南京建成SDH、ATP酶測試盒說明書方法檢測。肝臟UCP-2蛋白表達，免疫組織化學法檢測。將肝臟浸入4%多聚甲醛液中固定，常規脫水，石蠟包埋，切片，片厚5 μm；常規脫蠟和水化，92～98℃水浴熱修復30 min，冷卻至室溫，兔抗UCP-2單克隆抗體（1∶50）37℃ 2 h，二抗 37℃孵育 40 min，DAB 顯色。采用Imapage-Pro Plus 6.0圖像分析系統對UCP-2陽性免疫反應產物的面積及積分灰度值進行分析。

2.3 統計方法 采用SAS 8.2統計軟件包進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清LAC變化 與同期正常組比較，虛寒組大鼠血清LAC含量在造模第14天和第21天均明顯降低（P<0.05）。

表1 各組動物血清LAC變化（±s）Tab.1 Change of serum LAC of animals in each group（±s） μmol/L

表1 各組動物血清LAC變化（±s）Tab.1 Change of serum LAC of animals in each group（±s） μmol/L

注：與正常組比較，*P<0.05。

氫考劑量（mg/kg，肌注）正常組 12虛寒組 12組別 n 14 d 21 d-7.64±0.55 7.18±0.8320 5.25±0.17* 5.29±0.84*

3.2 肝組織SDH變化 與同期正常組比較，虛寒組大鼠肝組織勻漿中SDH活性在造模第14天和第21天均明顯降低（P<0.05）。

表2 各組動物肝勻漿SDH變化（±s）Tab.2 Change of SDH in liver homogenate of animals in each group（±s）U/mg pro

表2 各組動物肝勻漿SDH變化（±s）Tab.2 Change of SDH in liver homogenate of animals in each group（±s）U/mg pro

注：與正常組比較，*P<0.05。

組別正常組虛寒組n 氫考劑量（mg/kg，肌注）121214 d 21 d-3.76±0.58 5.02±1.2120 3.06±0.86* 4.10±0.60*

3.3 肝組織ATP酶變化 與同期正常組比較，虛寒組大鼠肝組織中Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性在造模第14天有降低趨勢，Ca2+-Mg2+-ATP酶有升高趨勢，均未見統計學差異；虛寒組大鼠肝組織中Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在造模第21天均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。

表3 各組動物肝勻漿ATP酶變化比較（±s，n=12）Tab.3 Change of ATPase in liver homogenate of animals in each group（±s，n=12）

表3 各組動物肝勻漿ATP酶變化比較（±s，n=12）Tab.3 Change of ATPase in liver homogenate of animals in each group（±s，n=12）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 氫考劑量（mg/kg，肌注）Ca2+-Mg2+ATP酶- 2.36±0.41 1.50±0.27 1.67±0.55 2.61±0.5120 2.31±0.23 1.40±0.17 1.37±0.23 2.74±0.46- 3.95±0.76 4.14±0.76 3.89±0.91 4.12±0.8720 3.46±0.30*3.14±0.40**3.25±0.35*3.46±0.32*時間14 d Na+-K+ATP酶Mg2+ATP酶Ca2+ATP酶正常組虛寒組正常組虛寒組21 d

3.4 肝組織UCP-2表達變化 與正常組比較，虛寒組肝臟UCP-2的陽性表達面積（Area）和積分光密度值（IOD）明顯降低（P<0.05）。

表4 各組動物肝臟UCP-2蛋白表達的變化（±s）Tab.4 Change of the expression of protein of hepatic UCP-2 of animals in each group（±s）

表4 各組動物肝臟UCP-2蛋白表達的變化（±s）Tab.4 Change of the expression of protein of hepatic UCP-2 of animals in each group（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05。

組別正常組虛寒組n 5 5氫考劑量（mg/kg，肌注） Area IOD-23.84±3.31 4.03±0.5220 18.48±1.79* 2.64±0.52*

4 討論

動物模型的塑造和構建，是中藥藥性理論實質研究的基礎。虛寒狀態動物模型則與辛熱藥藥性表達研究密切相關。近年來，有關虛寒狀態動物模型的研究日益增多，課題組運用數理分析方法對數百篇與虛寒動物模型相關文獻進行總結，選擇氫化潑尼松作為造模劑，制作虛寒狀態動物模型，并經過大量研究，確定造模劑量及模型成功和穩定時間[7-8]。在課題組前期工作的基礎上，本實驗選擇氫化潑尼松誘導虛寒狀態，以肝組織中SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、肝臟UCP-2蛋白表達，血清中LAC的含量作為指標，探討虛寒狀態下肝臟能量代謝變化特點。

能量代謝指隨著生命現象或作為其原因的能量的出入或轉換能量代謝方面，在化學鍵能（呼吸、發酵）或光能（光合成）直接轉化成熱量前，轉換成ATP等的高能鍵是其顯著的特征之一。機體能量代謝包括能量的生成和能量的分解兩部分。SDH是線粒體內三羧酸循環中的酶，其活性增高表明三羧酸循環的加快，同時也標志著細胞內ATP生成增強，LAC則是糖酵解途徑的產物，也與能量的生成有關。ATP酶又稱為三磷酸腺苷酶，是一類能將ATP催化水解為二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根離子的酶，這是一個釋放能量的反應，Na+-K+-ATP酶[9]、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶等酶的活性與能量代謝密切相關。王米渠等[10]研究發現寒證大鼠Na+-K+-ATP酶的活性比正常大鼠下降。張偉榮等[11]研究發現虛寒大鼠細胞能荷、肝臟Na+-K+-ATP酶活性、比虛熱大鼠低。本實驗結果顯示，虛寒狀態組血清LAC含量降低，肝組織中SDH活性降低，Na+-K+ATP酶、Mg2+ATP酶、Ca2+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性均明顯降低，提示虛寒狀態大鼠能量生成環節障礙。

此外，解偶聯蛋白家族（UCPs）作為一種線粒體轉運蛋白，在調節機體產熱和能量代謝方面發揮著重要作用。UCP通過催化質子的跨線粒體內膜運輸，降低線粒體內膜兩側的質子梯度，從而降低ATP生成，使產熱增加。UCP-2廣泛存在于動物的骨骼肌、肝臟、腎臟、肺、胃及小腸等組織的線粒體內膜上，它主要作用是通過消除線粒體內膜兩側的質子梯度差，從而使氧化過程和ATP生成的磷酸化過程解偶聯，使得氧化過程釋放的能量全部以熱能形式散失[12]。本實驗顯示，肝臟UCP-2表達降低，提示虛寒機體處在能量代謝障礙狀態。

綜上，虛寒狀態大鼠血清LAC含量，肝組織中ATP酶活性和UCP-2表達降低。可見，氫化潑尼松誘導的虛寒狀態動物模型存在能量代謝障礙。在虛寒狀態模型的制作和研究中，應注意能量代謝的相關變化，然能量代謝更深層的機制尚需進一步探討。

[1] 盧文麗,方肇勤.陽虛證動物模型的造模方法與評析[J].上海中醫藥大學學報,2004,18(4):45-48

[2] 吳啟端,熊帶水,梁文能.腎陽虛動物模型的研究概況[J].中國實驗方劑學雜志,2001,7(6):54-56.

[3] 陳英華,孫 琪,歐陽扶強,等.腎陽虛證動物模型造模方法綜述[J].中國醫藥學報,2003,18(6)：370-372.

[4] 陸 明,黃信勇,王米渠,等.虛寒證主觀感覺與客觀溫度變化的研究初探[J].現代中西醫結合雜志,2004,13（18）:2379-2380,2398.

[5] 陸 明,高 峰,丁維俊,等.虛寒證肢冷的能量代謝紊亂之機理探討[J].遼寧中醫雜志,2007,34（8）:1065-1066.

[6] 劉 欣,張 冰,劉小青,等.氫化可的松誘導大鼠類陽虛狀態的動態觀察[J].中華中醫藥雜志,2011,22（1）:126-128.

[7] 趙 茜,金 銳,張 冰,等.不同劑量氫化可的松誘導大鼠陽虛狀態的 Ridit分析[J].中西醫結合學報，2011,9（9）:941-947.

[8] 劉 欣,張 冰,劉小青,等.辛熱藥附子對類陽虛狀態的干預實驗研究[J].天津中醫藥,2011,28(1):69-71.

[9] 徐放明,郭 義,陳爽白.針刺中沖對急性缺氧小白鼠能量代謝的影響析[J].天津中醫藥,2005,22(2):126-127.

[10] 王米渠,嚴石林,李煒弘,等.寒熱性中藥對SD大鼠的實驗研究[J].浙江中醫學院學報,2002,26(6):43-45.

[11] 張偉榮.寒體熱體的實驗研究[J].中西醫結合雜志,1991,11(8):477-491.

[12] 黃麗萍,彭淑紅,蒙曉芳,等.6種寒性中藥對大鼠肝臟能量代謝的影響[J].中國中藥雜志,2009,34(24):3255-3258.