黃芪多糖對心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

李鐵成，張靜峰，馬寶豐，徐 芳，李德生，艾 浩

（遼寧醫學院附屬第三醫院，錦州 121000）

黃芪多糖（APS）是中藥黃芪的主要有效成分之一，具有調節免疫活性，抗炎抗氧化，減輕惡性腫瘤化療后的骨髓抑制等藥理作用[1-2]。近年研究發現黃芪多糖對心血管疾病具有一定的保護作用，其對糖尿病心肌病和心肌肥厚有一定的改善作用[3-4]。進一步研究顯示黃芪多糖對心肌缺血損傷也有一定的保護作用[5]。對心肌缺血再灌注損傷的深入研究發現，炎癥因子以及炎癥信號通路在心肌缺血再灌注損傷上發揮著至關重要的作用[6]，因此本研究以炎癥信號通路及炎癥因子為切入點，采用大鼠左冠狀動脈結扎的缺血再灌注模型，進一步探討了黃芪多糖對缺血再灌注損傷心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年雄性SD大鼠48只，體質量（220±40）g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2009-0004。

1.2 藥品與試劑 黃芪多糖，南京景竹生物科技有限公司，批號：JZ131209A；IκBα、p65 一抗：北京博奧森生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒：研域（上海）化學試劑有限公司。

1.3 分組與給藥 將48只SD大鼠按隨機數字表法隨機分為假手術組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（MI/R組）、黃芪多糖低劑量組（300 mg/kg），黃芪多糖高劑量組（600mg/kg）。假手術組只穿線不結扎，MI/R組結扎30min，再灌注120min。本實驗根據以往研究結論[7-8]和預實驗結果采用了300 mg/kg和600 mg/kg黃芪多糖于造模前7 d灌胃給予，1次/日。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 大鼠術前12 h禁食不禁飲，20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管，接人工呼吸機（頻率55次／分，潮氣量15 mL/kg），四肢皮下插入針型電極記錄心電圖，并接心電監護儀監測心電變化。在胸骨左緣2、3肋間開胸，暴露心臟，剔除心包，于肺動脈圓錐和左心耳之間距主動脈根部1 mm處找到左冠狀動脈，穩定10 min后，用剪去一條的細塑料管并行血管套于血管處，用3-0無創傷縫合線結扎套有塑料管的冠狀動脈，30 min后，用眼科剪刀剪去結扎線，移去管墊，再灌注120 min后取材測指標[9-10]。結扎后心電圖ST-T抬高，放松后ST-T回落50%為造模成功標志。

1.4.2 HE染色 再灌注后取下心肌組織置于10%甲醛液中保存48 h。固定脫水，石蠟包埋，連續切片，片厚 5 μm，60 ℃烤片，伊紅，蘇木素染色封片[11]，正置顯微鏡下拍照。

1.4.3 心肌梗死范圍測量 再灌注后取出心臟，切去心房及右心室，放入冰箱速凍1 h，在冠脈結扎線下平行于冠狀溝將心室等厚切成5片，放入0.1%氯化硝基四氮唑藍（NBT）溶液中，于37℃恒溫水浴振搖染色10 min。正常心肌染色為暗藍色，梗死區心肌不著色為淺紅色，用4%的多聚甲醛固定,分開梗死區與非梗死區心肌,計算梗死面積百分比。梗死面積%＝（梗死區心肌質量/整個左心室質量）%。

1.4.4 ELISA檢測血清TNF-α和IL-6含量 大鼠頸動脈取血，離心后收集上層血清，按試劑盒說明書操作測定血清中TNF-α和IL-6含量。

1.4.5 IκBα、p65蛋白表達的檢測 取部分梗死區心肌組織，用PBS沖洗，置于－70℃冰箱備用。測定指標時，取出樣品，BCA法蛋白定量。然后每組取10 μL樣品以及蛋白標準物點樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始電壓為90 V，觀察Marker的移動情況，適時終止電泳。轉膜、封閉、洗膜，切割后分別與其特定的稀釋過的IκBα、p65一抗4℃雜交過夜，用洗膜液洗膜3次后與稀釋過的二抗反應，搖床上雜交1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，化學發光凝膠成像系統檢測。

1.4.6 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據統計，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理因素對心肌形態學變化的影響 假手術組心肌組織肌纖維排列整齊，無凋亡和炎性細胞侵潤的形態學變化。模型組心肌組織肌纖維排列紊亂，部分出現斷裂，有少量炎性細胞浸潤。而高劑量黃芪多糖組可部分改善上述心肌組織的形態學變化。見圖1。

2.2 心肌梗死面積結果 與缺血組相比，黃芪多糖低劑量組可縮小心肌組織的梗死面積，而黃芪多糖高劑量組心肌組織梗死面積進一步減小。見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積結果（±s）Tab.1 Myocardial infarct sizes in each group（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積結果（±s）Tab.1 Myocardial infarct sizes in each group（±s）

注：與 Sham 組比較，**P＜0.01；與 MI/R 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別Sham組MI/R組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組n6666劑量（mg/kg） 梗死面積（%）-1.36±0.0840.98±6.63**300 32.13±4.14#600 26.23±3.86##-

2.3 黃芪多糖對大鼠血清TNF-α和IL-6含量的影響 如表2所示，心肌缺血再灌注損傷時大鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著增加，黃芪多糖可不同程度的降低上述炎癥因子的增加。

圖1 心肌組織形態學變化Fig.1 Morphological changes in heart tissue of different groups

表2 黃芪多糖對TNF-α和IL-6含量（±s）Tab.2 Effects of APS on TNF-α and IL-6 content（±s）ng/L

表2 黃芪多糖對TNF-α和IL-6含量（±s）Tab.2 Effects of APS on TNF-α and IL-6 content（±s）ng/L

注：與 Sham 組比較，**P＜0.01；與 MI/R 組比較，##P＜0.01。

組別Sham組MI/R組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組n 6 6 6 6劑量（mg/kg）--300600 TNF-α 25.7±4.2154.8±8.6**105.3±4.9##60.8±9.7##IL-659.8±6.3148.8±6.6**110.6±8.3##89.8±9.7##

2.4 黃芪多糖對心肌組織IκBα、p65蛋白表達的影響 缺血再灌注損傷時，IκBα表達降低，而p65表達增加，提示缺血再灌注損傷時有NF-κB通路激活。黃芪多糖預處理可降低p65表達而增加IκBα表達，表明黃芪多糖對心肌缺血再灌注損傷激活的NF-κB有一定的抑制作用。見圖2。

圖2 IκBα、p65蛋白表達Fig.2 Protein expression of IκBα and p65

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是導致心肌急慢性損傷的重要病理生理過程，雖然這一復雜病理生理過程的機制還不是很明確，但大量研究顯示炎癥反應在這一過程中發揮了重要作用。核轉錄因子-κB（NF-κB）是一種具有基因轉錄多向調控作用的核轉錄因子。NF-κB最常見的是由p65與p50或p52組成的同源或異源二聚體，生理條件下，IкBα通過其特征性錨定蛋白與NF-кB二聚體結合，掩蓋其核定位信號，從而抑制NF-кB活性[12]。缺血再灌注損傷時IкBα蛋白降解，與NF-кB解離，使其活化。NF-кB的活性增加可使炎癥因子如TNF-α，IL-6等釋放[13]。TNF-α的釋放增加可降低心肌收縮性，降低血壓，促進中性粒細胞黏附等，加重炎癥反應發生，使缺血的心肌損傷進一步惡化[14]，因此抑制NF-кB活化，抑制炎癥反應對心肌缺血在灌注損傷具有重要意義。

本研究發現在缺血再灌注損傷發生后，炎癥因子表達增加，p65表達增加，而IкBα表達降低，證實了上述說法。黃芪多糖預處理后改善了心肌組織的形態學變化，降低心肌梗死面積，提示黃芪多糖對缺血再灌注損傷的心肌有一定的保護作用。進一步研究顯示黃芪多糖在改善缺血再灌注損傷的同時，降低了缺血再灌注損傷所致的TNF-α，IL-6含量增加，抑制了p65蛋白表達增加，增加了IкBα蛋白表達，提示黃芪多糖對缺血再灌注損傷的保護作用可能是通過抑制NF-кB，進而抑制炎癥反應相關。本研究結果進一步證實了黃芪多糖對缺血再灌注心肌的保護作用，為中藥黃芪的開發提供了參考。

[1] Huang WM,Liang YQ,Tang LJ,et al.Antioxidant and anti-inflammatory effects of Astragalus polysaccharide on EA.hy926 cells[J].Exp Ther Med，2013,6(1):199-203.

[2] 趙美蓉，周 潔.黃芪多糖對惡性腫瘤化療后骨髓抑制的影響[J].天津中醫藥，2007,24(2):114-115.

[3] Chen W,Xia Y,Zhao X,et al.The critical role of Astragalus polysaccharides for the improvement of PPARα [correction of PPRAα]-mediated lipotoxicity in diabetic cardiomyopathy[J].Plos One，2012,7(10):e45541.

[4] 孫雪芳，王洪新，梁靈君，等.何海洋黃芪多糖通過TLR4/NF-KB信號通路抑制脂多糖誘導的大鼠心肌細胞肥大[J].中國藥理學通報,2013,29(2):208-212.

[5] 張 灼，陳立新，宋崇順，等.黃芪多糖對大鼠心肌缺血-再灌注損傷后的保護作用[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(2):33-34

[6] Liang X,Huang J,Lin X,et al.The Effect of 17-Methoxyl-7-Hydroxy-Benzene-Furanchalcone on NF-κB and the Inflammatory Response During Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Rats[J].J Cardiovasc Pharmacol,2014,63(1):68-75.

[7] Zou F,Mao XQ,Wang N,et al.Astragalus polysaccharides alleviates glucose toxicity and restores glucose homeostasis in diabetic states via activation of AMPK[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(12):1607-1615.

[8] 宋 瑩,王洪新,張 晶,等.黃芪多糖對腹主動脈縮窄致大鼠心肌肥厚能量代謝紊亂的抑制作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2012,26(2):177-182.

[9] 王 怡，王少峽，任 明，等.首烏丹參方預處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌保護作用研究[J].天津中醫藥，2006,23（5）：413-416.

[10] Lin J,Wang H,Li J,et al.κ-Opioid receptor stimulation modulates TLR4/NF-κB signaling in the rat heart subjected to ischemiareperfusion[J].Cytokine,2013,61(3):842-848.

[11] 趙海濱，張秀靜,王帥,等.BMSCs“歸巢”在AMI后心肌重塑中的作用及活血化瘀藥的干預研究 [J].天津中醫藥大學學報,2013,32（1）：29-31.

[12] 張 蕊，馬 璇，劉 琳，等.藻藍蛋白對2型糖尿病大鼠胰島細胞NF-κB和IκB表達的影響[J].天津中醫藥大學學報,2010,29（1）：27-29.

[13] Wu Y,Liu Y,Huang H,et al.Dexmedetomidine inhibits inflammatory reaction in lung tissues of septic rats by suppressing TLR4/NF-κB pathway[J].Mediators Inflamm,2013,562154:1-9.

[14] Shimamoto A,Chong AJ,Yada M,et al.Inhibition of Toll-like receptor 4 with eritoran attenuates myocardial ischemia–reperfusion injury[J].Circulation,2006,114(1 Suppl):1270–1274.