HPLC法測定苦木中3種活性成分的含量*

姚小華，匡艷輝，黃國鑫，黃 琳，林 青

（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現代中藥研究院，廣州 510515）

苦木為苦木科植物苦木Picrasma quassioides（D.Don）Benn.的干燥枝及葉。收載于《中國藥典》2010年版一部。性寒，味苦。具有清熱，祛濕，解毒之功效，用于治療風熱感冒，咽喉腫痛，腹瀉下痢，濕癤，毒蛇咬傷等癥[1]，是消炎利膽片等中成藥的主要藥材原料。苦木藥材質量標準尚無定量測定項，標準亟待提高，目前卻鮮見苦木藥材中生物堿定量測定研究報道。苦木主要含生物堿、苦味素、苦木內酯等[2-4]，生物堿主要為鐵屎米酮類生物堿、β-carboline類生物堿及二聚體生物堿[5]。據文獻報道，鐵屎米酮類是苦木藥材的主要化學成分，具有顯著的抑菌作用[6-11]。為了有效控制苦木藥材質量，比較不同藥用部位的差別，從藥材中分離得到苦木堿乙，苦木堿己和苦木堿丁經結構鑒定并進行純度檢查，以其為對照品對苦木藥材用高效液相色譜儀（HPLC）法進行定量測定研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，BT214D電子分析天平（瑞士沙多利斯Sartorius公司），CP225D電子分析天平（瑞士沙多利斯Sartorius公司），SB25-12DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

苦木堿乙（自制，HPLC檢測純度：99.26%，歸一化法），苦木堿己（自制，HPLC檢測純度：98.45%，歸一化法）和苦木堿丁（自制，HPLC檢測純度：99.13%，歸一化法），苦木藥材采收于廣西，經鑒定為苦木科植物苦木Picrasma quassioides（D.Don）Benn.的干燥枝及葉，乙腈為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱：采用Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）－0.2%磷酸（B）梯度洗脫 0～35 min，5%A→45%A，35～40 min，45%A→80%A，40～50 min，80%A→90%A，50～60 min，90%A→95%A，流速：1mL/min，檢測波長：210 nm，柱溫：30 ℃。進樣量：10 μL。HPLC色譜圖見圖1。

圖1 苦木藥材和對照品溶液的圖譜Fig.1 Atlas of Picrasma quassioides and control solution

2.2 對照品溶液的制備 分別取苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁3種對照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇制成1 mL含苦木堿乙10 μg、苦木堿己 30 μg，苦木堿丁 20 μg的溶液，即得。4 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取苦木藥材粗粉約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質量，回流提取1.5 h，放冷，加80%甲醇補足減失的質量，搖勻，取上清液，采用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性范圍考察 精密吸取上述3個成分的對照品溶液各 1、2、5、10、15、30 μL，在上述色譜條件下,分別進樣進行測定。以峰面積Y贊為縱坐標，進樣量X（μg）為橫坐標進行線性回歸，結果苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁回歸方程、相關系數和線性范圍，見表1。

表1 3個成分的回歸方程、相關系數和線性范圍Tab.1 Regression equation and correlation coefficient and the linear range of the 3 components

2.5 精密度實驗 取同一苦木藥材供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，記錄苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁的峰面積，計算精密度，RSD=0.19%、RSD=0.14%、RSD=1.00%，表明方法精密度好,見表2。

表2 3個成分的精密度實驗結果Tab.2 The results of precision test of 3 components

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一苦木藥材供試品溶液，分別于配制后的 0，3，6，9，12，24 h 進樣，每次 10 μL，測定苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁的峰面積積分值，RSD=0.81%、RSD=0.45%、RSD=2.09%。表明處理后的樣品在1 d內穩(wěn)定。見表3。

表3 3個成分的穩(wěn)定性實驗結果Tab.3 The results of stability test of 3 components

2.7 重復性實驗 精密稱取苦木藥材粉末（過四號篩）約1.0 g，共6份，按2.3.1項下制備樣品，測得苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁平均含量的相對標準偏差分別為RSD=2.82%、RSD=1.00%、RSD=2.06%。見表4。

表4 3個成分的重復性實驗結果Tab.4 The results of reproducibility test of 3 components

2.8 準確度實驗 分別取已知含量的苦木藥材粉末樣品約0.5 g，精密稱定，準確加入一定量的苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁，按2.3項下制備供試品溶液，按2.1項條件測定，計算苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁的平均回收率，結果見表5。

2.9 不同批次產地的苦木藥材測定 分別取5個不同批次和產地的苦木藥材粉末樣品約1.0 g，精密稱定，按2.3.1項下制備樣品，測得苦木堿乙、苦木堿己、苦木堿丁平均含量，結果見表6。

3 討論

苦木藥材中的有效成分為生物堿，苦木堿乙，苦木堿己，苦木堿丁為其中主要成分[11]，目前未見這3種生物堿同時進行含量測定的研究報道，經紫外掃描測定其最大吸收波長均為210 nm末端吸收，對不同的流動相體系進行摸索后確定以乙腈-0.2%磷酸為流動相梯度洗脫分離，以上3種生物堿與其他峰基線達到完全分離。

含量測定結果顯示，苦木藥材中苦木堿己（4-甲氧基-5-羥基-鐵屎米酮）含量較高，苦木堿乙（1-甲氧甲酰-β-咔巴啉）和苦木堿丁（4，5-二甲氧基-鐵屎米酮）含量較低，個別批次的苦木藥材未檢測到苦木堿丁，不同批次的苦木藥材中3種生物堿的含量相差也較大。苦木制劑系苦木干燥枝或莖加工而制成，經測定，莖和枝中苦木堿己和苦木堿丁含量相差很大[11]，因此，有必要對苦木原藥材進行質量控制，以保證制劑質量穩(wěn)定均一。

表5 苦木藥材加樣回收率測定結果(n=6)Tab.5 The results of recovery test of Picrasma quassioides(n=6)

表6 不同批次產地的苦木藥材測定結果Tab.6 The results of samples of different batches of Picrasma quassioides mg/g

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