高效液相色譜法測定三金顆粒中羥基積雪草苷含量

朱雪妍，林燕翔

（廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

三金顆粒是由金櫻根、金剛刺、羊開口等5味中藥制備而成，具有清熱解毒、利濕通淋、益腎的功效。目前三金顆粒的質量標準[1]均過于簡單，沒有含量測定項目。為確保臨床療效及有效控制產品質量，筆者以羥基積雪草苷[2－3]作為含量測定指標，建立了三金顆粒中積雪草[4]的含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀；Chemstation色譜工作站；MILLIPROA純水處理器。羥基積雪草苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110893－200201，供含量測定用，經高效液相色譜法測定純度為97．35%）；三金顆粒（市售品）；乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：ODS Hypersil C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），流動相：乙腈 －2 mmol／L β－環糊精溶液（24 ∶76）；流速：1．0 mL ／min；檢測波長：205 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

取羥基積雪草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0．2 mg的溶液，即得對照品溶液。取裝量差異項下的本品內容物，混勻，研細，取約10 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率 320 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，減壓回收至干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，取正丁醇液，減壓回收至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取缺積雪草陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法進行操作，制備得陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

干擾試驗：分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2．1項下色譜條件記錄色譜圖。結果見圖1，表明陰性樣品對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密稱取羥基積雪草苷對照品22．48 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密吸取以上對照品溶液 0．1，0．3，1．0，5．0，10．0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密量取以上溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行測定。以對照品進樣量為橫坐標（X）、峰面積積分值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程Y＝182．48X＋5．454 4，r＝0．999 9（n＝5）。結果表明，羥基積雪草苷進樣量在 0．218 8 ～21．884 3 μg范圍內峰面積積分值呈良好的線性關系。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按2．1項下色譜條件連續測定6次。結果羥基積雪草苷峰面積的RSD為0．35%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

穩定性試驗：取同一對照品溶液（批號為100701），每隔一定時間測定1次，共測定5次。結果羥基積雪草苷峰面積的RSD＝1．36%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為100701），依法制備供試品溶液，按2．1項下色譜條件平行測定6次。結果羥基積雪草苷平均含量為 0．097 31 mg／g，RSD＝2．41%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取羥基積雪草苷對照品20．46 mg（含量為97．35%），精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取 2．00，5．00，10．00 mL，分別置 200 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液A，B，C。取已知含量的樣品（批號為100701，羥基積雪草苷含量為0．097 31 mg／g），研細，取約5 g，精密稱定（共9份），置錐形瓶中，分為3組，分別精密加入對照品溶液A，B，C 50 mL，按供試品溶液制備方法制備待測溶液并依法測定含量，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 羥基積雪草苷加樣回收試驗結果（n＝9）

2．4 樣品含量測定

取10批樣品，按擬訂的方法測定含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝2）

3 討論

曾用ODS HYPERSIL C18柱，Symmetry及Kromasil C18柱等不同品牌色譜柱測定同一樣品（批號為100701）含量，結果色譜圖中羥基積雪草苷峰與相鄰雜質峰分離良好，理論板數均在5 000以上，且3根不同品牌色譜柱測得的羥基積雪草苷含量的RSD為25%，說明系統適用性良好。

對于樣品提取方法，分別用超聲提取和加熱回流提取進行比較，結果以超聲提取較完全；對提取溶劑甲醇、80%甲醇、無水乙醇進行了考察，結果表明，采用甲醇提取較為完全；還對提取時間（20，30，60 min）進行了考察，結果以30 min和60 min提取的更完全，且相差不大；再對水飽和的正丁醇萃取次數（2，3，4次，每次20 mL）進行了考察，結果表明，萃取3次即可提取完全；最后比較了用氨試液洗滌次數（1，2，3次，每次20 mL），結果表明通過堿洗能大大減少雜質對色譜分析的影響，且洗滌2次即可除去較多的雜質。

[1]WS3－B－3746－98．中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第二十冊）[S]．

[2]陳云艷，翁小香，周 靖，等．積雪草總苷及其制劑的含量研究．Ⅱ．積雪草總苷中積雪草苷，羥基積雪草苷和積雪草苷B含量的HPLC法測定[J]．中國醫藥工業雜志，2010，41（4）：276 －279．

[3]楊于琴，丁永輝，夏玉鳳．積雪草活性成分的分析方法及藥理作用研究進展[J]．中國野生植物資源，2010，29（3）：6 －9．

[4]齊紅梅，王冬梅．積雪草化學成分及藥理研究進展[J]．中國藥業，2010，19（16）：89 － 90．