IL-6基因啟動子區-634C/G多態性與糖尿病視網膜病變的關系

安新煥，梁干雄，武會娟

論 著

IL-6基因啟動子區-634C/G多態性與糖尿病視網膜病變的關系

安新煥1，梁干雄1，武會娟2

目的 探討白細胞介素-6(IL-6 gene ，IL-6)基因啟動子區-634C/G多態性與中國廣東地區漢族人糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者視網膜病變(diabetic retinopathy ,DR)的關系。方法 在中國廣東地區漢族人中，應用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性(PCR-RFLP )方法,對245例2型糖尿病(T2DM)患者，其中正常眼底即DR0組153例，非增殖期視網膜病變即DR1組51例，增殖期視網膜病變即DR2組41例，和101例健康對照者(NC組)的IL-6基因啟動子區-634C/G多態性進行了檢測，并比較分析各組間基因型頻率和等位基因頻率以及相關臨床資料。結果 (1)DR0、 DR1、 DR2三組間在年齡、性別、血壓、體重指數、腰臀比、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白A1c、血脂等指標均無統計學差異，而病程在三組間差異具有統計學意義(F=19.05，P<0.05)。(2) 基因型GG在NC、DR0、DR1、DR2各組間差異有統計學意義(χ2=20.839，P=0.002)，DR1、DR2組GG基因型明顯高于DR0組，差異有統計學意義(χ2=7.615，P=0.022)；等位基因G在NC、DR0、DR1、DR2各組間差異有統計學意義(χ2=11.687，P=0.009)，但兩組間比較差異無統計學意義。(3)Logistic回歸分析表明，IL-6基因啟動子區-634G/G 基因型、病程及空腹血糖是DR發生的危險因素。結論 在中國廣東地區漢族人中，IL-6基因啟動子區-634 G/G基因型是DR的遺傳危險因素。

白細胞介素-6基因；啟動子區；多態性 ；糖尿病視網膜病變

視網膜病變(diabetic retinopathy ,DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見且難治的并發癥之一, 在歐美各國四大致盲眼病中占第二位, 在我國也是主要致盲病之一[1]。DR的發病機制主要和環境與遺傳因素有關。炎性反應的核心細胞因子IL-6在房水和玻璃體液中的濃度與DR的嚴重程度高度相關。有研究表明[2]，IL-6基因啟動子區存在-643C/G多態性，且與IL-6表達有關,目前有關此多態性與DM視網膜病變的關系未見報道。為此，筆者選取2012-01至2013-03我院住院患者245例，就此多態性進行檢測，旨在探討IL-6基因啟動子區-634C/G多態性是否與中國廣東地區漢族人DR存在關聯。

1 對象與方法

1.1 研究對象 所有患者均符合1991年WHO T2DM診斷標準且彼此間無親緣關系。按眼底鏡檢查結果分為無DR組(DR0組)、非增殖期DM視網膜病變組(DR1組)和增殖期DM視網膜病變組(DR2組)。無DM、高血壓病家族史，且血糖、血脂、血壓均正常者作為對照組(NC組)。DR0組153例，男77例，女76例，平均(50.74±14.69)歲；DR1組51例，男19例，女32例，平均(55.06±13.81)歲；DR2組41例，男17例，女24例，平均(61.12±9.62)歲； NC組健康對照者101名，男56名，女45名，平均(47.51±8.21)歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 選用QIAamp DNA Mini kit試劑盒按說明書提取模板DNA。

1.2.2 IL-6基因啟動子區-634C/G多態性檢測 采用PCR-RFLP方法檢測。引物參照kitamura等[2]報道的文獻設計，由北京市理化分析測試中心合成，上游引物為：5′-GAGACGCCTTGAAGTAACTG-3′，下游引物為5′-AACCAAAGAT GTTCTGAACTGA-3′。PCR反應體系：模板1 μl，其余組分的最終濃度分別為dNTP 56 μmol/L，引物(一對)30 μmol/L，Taq DNA聚合酶5 U,10倍的反應緩沖液5 μl, 鎂離子2.0 mmol/L，加雙蒸水至50 μl。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s,共30個循環，終末延伸72 ℃， 5 min。在BIO-RAD S1000基因擴增儀(美國BIO-RAD公司生產)中進行PCR，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳證實，然后以限制性內切酶MbiI(BsrBI)進行消化9 h，消化產物經2%瓊脂糖凝膠電泳(電壓80 v，時間45 min)及溴化乙錠染色后采用Gel Doc 1000紫外檢測系統(美國BIO-RAD公司)觀察結果(圖1)。

圖1 酶解后瓊脂糖凝膠電泳

M為DNA分子量標記；1、4為GG基因型，2、8為CG基因型，3、5、6、7為CC基因型

PCR擴增的目的片段長度為180 bp，據酶切后產生片段長度的不同判斷基因型，CC基因型為180 bp一條片段，CG基因型為180 bp 、120 bp、 60 bp 三條片段，GG基因型為120 bp和60 bp兩條片斷(60 bp片段看不到)。對酶切后確認基因型為CC型和GG型的兩份標本進行測序(圖2)，以證實酶切后確認的基因型是否正確 。

A

B

1.2.3 臨床及生化指標檢測 全自動生化分析儀檢測血糖、血脂，用親和層析法測HbA1C，測量身高、體重、腰圍、臀圍，并計算體重指數(body mass index ，BMI)和腰臀比(waist hip ratio, WHR)。

2 結 果

2.1 DM三組臨床及生化指標比較 由表1可見，DR0 、DR1、 DR2三組在年齡、血壓、BMI、WHR、空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)、餐后2 h血糖( 2 hour postprandial plasma glucose,2 hPG)、糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c,HbA1C)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)等指標均無統計學意義，但病程三組間比較差異具有統計學意義(F=19.05，P<0.05)。

2.2 各組間基因型頻率和等位基因頻率比較 由表2可見，基因型GG在NC、DR0、DR1、DR2各組間有統計學差異(χ2=20.839，P=0.002)，DR組GG基因型明顯高于DR0組， 且具有統計學意義 (χ2=

7.615，P=0.022)；等位基因G在NC、DR0、DR1、DR2各組間有統計學差異(χ2=11.687，P=0.009)，但兩兩組間比較無統計學意義。

2.3 DR相關危險因素的Logistic回歸分析 IL-6基因啟動子區-634G/G基因型、病程及空腹血糖是DR發生的危險因素，見表3。

表1 糖尿病視網膜病變各組間臨床資料對比 ±s)

注： 與DR0組比較，①P<0.05；與DR1組比較，②P<0.05

表2 糖尿病視網膜病變各組IL-6基因頻率和等位基因 (n;%)

注：表內顯示例數(頻數)

表3 Logistic回歸分析結果

3 討 論

DR在我國是主要致盲病之一。我國DM 患者中DR發生率為25.12%, 且初診的T2DM患者中DR發生率就高達12.14%。正因為如此，DM及DR已成為世界各國疾病防治和研究的重點，在我國顯得尤其重要。

DR的發病機制是環境和遺傳因素共同作用。DM發生后，由于高血糖的作用，葡萄糖自身氧化、蛋白質非酶糖基化增強，多元醇通路激活，抗氧化系統清除能力減弱，氧化應激增強，使單核細胞產生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增多，促炎性反應轉錄因子-核因子-кB(transcription factor nuclear factor-к,BNF-кB)活性增強，從而產生炎性反應，使炎性反應細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor ,TNF)-α等增加，引起炎性反應的放大及惡性循環。越來越多的證據顯示，糖基化終末產物(glycation end products,AGEs)和其受體(RAGE)結合能誘導細胞內氧化應激，引起炎性反應和( 或) 血栓形成，參與DM血管病變發病機制。在DM視網膜病變晚期，AGEs不可逆轉地在視網膜毛細血管細胞內堆積，AGEs和RAGE相互作用激活核轉錄因子NF-κB，繼而生成過量ROS并激活caspase 3，進一步引起細胞損傷并觸發細胞凋亡[3]。作為炎性反應的核心細胞因子IL-6，DM視網膜病變患者淚液中IL-6表達量明顯高于DM無視網膜病變患者[4]，其在房水、玻璃體及淚液中的濃度與DR的嚴重程度高度相關[5],并且活動性DM增殖期視網膜病變(PDR) IL-6水平明顯高于靜止PDR[6,7]。最近研究發現，血清中IL-6在DM及非增殖期DM視網膜病變患者中無差異，而在增殖期DM視網膜病變患者中明顯升高[8]；彭灣灣等[9]也發現，血清IL-6含量與DR的嚴重程度呈正相關；體外培養視網膜Muller細胞顯示：糖化蛋白終末產物可引起視網膜Muller細胞產生IL-6，并且存在劑量依賴關系，IL-6的增加與DR的發生發展密切相關。

DR 的顯著特征是血-視網膜屏障損害, 研究發現血-視網膜屏障損害與細胞 因子之間存在著密切關系。高血糖首先引起的是眼局部血液動力學的改變, 繼之大量糖基化終末產物誘導產生大量的細胞因子, 引起視網膜組織缺血, 血-視網膜屏障破壞導致視網膜病變的產生。IL -6可能是 DR 的主要介質, 通過誘導血管內皮生長因子促進新生血管形成和增加血管滲透性, 同時通過改變內皮細胞形態來增加內皮細胞通透性, 與DR 嚴重程度密切相關[10]。

本研究結果顯示，NC組GG基因型頻率高于DR0組，這種差異具有統計學意義，隨著病情加重，GG基因型頻率有增高的趨勢，但差異無統計學差異。為評價IL-6基因啟動子區-634C/G多態性和一些臨床因素與DR的關系，用逐步選擇法作Logistic回歸分析表明IL-6基因啟動子區-634G/G 基因型、空腹血糖及病程是DR發生的危險因素。在中國廣東地區漢族人中，IL-6基因啟動子區-634 G/G基因型是DR的遺傳危險因素，而在其他地區漢族人中未見報道，在廣東地區少數民族人口中亦未見報道。等位基因G在NC、DR0、DR1、DR2各組間差異有統計學意義，但兩兩組間比較差異無統計學意義。由此可見，等位基因G與DR的發生發展關系不大。

有學者在IL-6 基因-634C/G多態性研究中進行體外單核細胞培養時，發現GG基因型攜帶者的單核細胞IL-6含量及分泌能力均明顯增加，進一步提示IL-6 基因與DR的密切關系[2]。然而，DR患者IL-6基因表達和產物產生的精確機制并不十分清楚，IL-6與DM 、DR的關系，尚待深入探討。

[1] Malone J I , Morrison A D , Pavan P ,etal.Prevalence and significance of retinopathy in subjects with 1 diabetes of less than 5 years duration screened for the diabetes control and complications trial [J].Diabetes Care, 2001,24(3):522-526.

[2] Kitamura A, Hasegawa G, Obayashi H,etal. Interleukin-6 polymorphism (-634C/G) in the promotor region and the progression of diabetic nephropathy in type 2 diabetes. Diabetes med,2002,19(12):1000-1005.

[3] Sheikpranbabu S,Haribalaganesh R,Banumathi E,etal.Pigment epithelium-derivedfactorinhibitsad vancedglycationend-product-inducedangiogenesisandstimulates apoptosisinretinal endothelial cells[J]． Life Sci，2009，85:719-731．

[4] 張 潔，王偉超，張慶玉，等.2型糖尿病患者淚液白細胞介素6的表達[J].江蘇醫藥，2013，39(3)：285-286.

[5] 周 林，孫 昊，徐 岬，等.VEGFIL-6的水平與糖尿病視網膜病變關系的研究[J].眼科學報，2010，25(1)：26-30.

[6] Funatsu H, Yamashita H, Noma H,etal.Aqueous humor levels of cytokines are related to vitreous levels and progression of diabetic retinopathy in diabetic patients[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2005,243(1):3-8.

[7] 張 潔，王偉超，劉素波，等.不同分期糖尿病視網膜病變淚液IL- 6的表達[J].中國現代醫學雜志，2012，22(14)：51-54.

[8] Carin, Gustavsson，Carl D，etal.Profile of intraocular tumour necrosis factor-α and interleukin-6 in diabetic subjects with different degrees of diabetic retinopathy [J]. Acta ophthalmologica, 2013,91(5):445-452.

[9] 彭灣灣，曾姣娥.PEDF IL-6與2型糖尿病視網膜病變的臨床研究[J].醫學研究雜志，2013，42(10)：155-157.

[10] 蔣 玲,呂紅彬.細胞因子與糖尿病視網膜病變的研究進展[J].眼科研究,2009,27(12):1166-1167.

(2014-04-10收稿 2014-08-11修回)

(責任編輯 郭 青)

Association of IL-6 gene promoter region -643C/G polymorphism with diabetic retinopathy

AN Xinhuan1,LANG Ganxiong1, and WU Huijuan2.

1.Department of Diabetes，Zhongshan People’s Hospital, Zhongshan 528400, China; 2. Beijing Physical and Chemical Analysis and Testing Center, Beijing 100094,China

Objective To investigate the association of IL-6 gene promoter region -643C/G polymorphism with diabetic retinopathy. Methods The polymorphism of IL-6 gene promoter region -634 C/G in 245 unrelated Guangdong Han people with type 2 diabetes ,including 153 cases without diabetic retinopathy (DR0 group) ,51 cases without proliferative diabetic retinopathy (NPDR)(DR1 group), 41 cases with proliferative diabetic retinopathy (PDR) (DR2 group), and 101 normal controls(NC group) were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) methods. The genotype frequency, allele frequency and relative clinical data were compared between groups. Results (1)There were no significant differences in the clinical characteristics except for diabetic duration among DR0， DR1， DR2 groups. (2) The frequencies of IL-6-643 G/G genotype and G allele frequencies among DR0 DR1 DR2 groups were statistically different. There were significantly different in GG genotype between DR0 and DR group,comparison between any two means were not significant differences in G allele frequencies.(3) Logistic regression analysis showed that IL-6 gene promoter region-643G/G genotype，fasting plasma glucose and diabetic duration were risk factors of DR. Conclusions The IL-6 promoter region-643G/G genotype may be a genetic risk factor of DR development.

IL-6 gene; promoter region; polymorphism; diabetic retinopathy

廣東省中山市科技局基金資助項目(2006A035)

安新煥，碩士，副主任醫師，E-mail:axh1998@sina.com

1. 528400，廣東省中山市人民醫院內分泌科，2. 100094，北京市理化分析測試中心

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