高原習服過程淋巴細胞線粒體DNA含量及氧化損傷變化規律

薄 海，果鳳春，段富強，彭 朋，秦永生

論著

高原習服過程淋巴細胞線粒體DNA含量及氧化損傷變化規律

薄 海1,2，果鳳春3，段富強4，彭 朋1，秦永生1

目的觀察世居平原男性青年高原習服各時程淋巴細胞線粒體能量代謝、線粒體DNA(mtDNA)拷貝數及其氧化損傷的動態變化規律。方法27名世居平原武警新兵急進高原，分別在移居高原3、7、90 d檢測淋巴細胞線粒體膜電位、mtDNA中8-oxodG含量、mtDNA拷貝數和PGC-1α蛋白表達。結果與平原階段比較，移居高原3 d和7 d，膜電位顯著降低(P<0.05)，8-oxodG含量，mtDNA拷貝數和PGC-1α表達顯著升高(P<0.05)；移居高原90 d，mtDNA拷貝數和PGC-1α表達顯著降低(P<0.05)。移居高原90 d與移居高原7 d比較，膜電位顯著升高(P<0.05)，8-oxodG含量，mtDNA拷貝數和PGC-1α表達顯著降低(P<0.05)。結論高原習服初期淋巴細胞能量重構主要依賴于線粒體數量增加，而在高原習服后期主要依賴于單個線粒體健康程度及能量代謝水平提高。

高原習服；淋巴細胞；線粒體DNA；拷貝數；氧化損傷

高原習服，是人類從低海拔地區進入高海拔環境后，機體為適應低氧環境發生的一系列提高低氧耐受能力的適應性變化。前期研究發現，久居平原武警新兵急進高原7 d，血氧飽和度即恢復至久居高原人群水平；移居高原90 d，心輸出量明顯高于急進高原7 d[1]。這表明在高原習服過程中，機體氧攝取和運輸發生了明顯的適應性變化。線粒體是細胞主要氧利用和能量合成場所。研究表明，急性高原低氧暴露抑制淋巴細胞線粒體復合體Ⅰ和Ⅲ活性，降低線粒體呼吸速率[2]。羅勇軍等[3]報道，平原漢族人群移居高原1年，白細胞線粒體DNA拷貝數顯著高于平原人群。因此，可以認為線粒體數量和質量適應性變化是高原低氧習服的重要環節。本研究擬觀察世居平原男性青年高原習服各時程線粒體能量代謝、線粒體DNA(mtDNA)拷貝數及其氧化損傷的動態變化規律，并探討其生物學意義。

1 對象和方法

1.1 對象 采取整群抽樣法，選取同年招收的武警新兵中無進駐高原經歷的青年男性27名為受試者，年齡(18.35±0.85)歲，身高(172.51±5.15) cm，體重(60.74±7.01) kg。所有受試者同批次由平原地區(成都，海拔約500 m)乘飛機直接到達高原地區(拉薩，海拔約3700 m)。

1.2 方法 參照《高原習服評價指標與方法》(國家軍用標準GJB4301-2002)劃分的習服進程[4]，分別在平原階段、急進高原階段(3 d)、高原初步習服階段(7 d)和高原基本習服階段(90 d)，抽取空腹靜脈血5 ml，EDTA抗凝。

1.3 淋巴細胞分離 抗凝血用PBS等體積稀釋，緩慢加入等體積的淋巴細胞分離液，800 g離心20 min，取淋巴細胞層，PBS洗滌兩次，1000 g離心20 min，棄上清，收集淋巴細胞。留取部分細胞測定線粒體膜電位，其余細胞-20 ℃凍存。

1.4 淋巴細胞線粒體膜電位測定 采用JC-1熒光探針檢測淋巴細胞線粒體膜電位[5]。操作嚴格按照試劑盒說明書進行(碧云天生物技術研究所)，將細胞加入0.9 ml JC-1染色工作液，加入3 μmol洋地黃皂甙透膜3 min。37 ℃避光水浴10 min。加入3 μmol蘋果酸和8 μmol谷氨酸啟動線粒體呼吸，熒光分光光度計測定紅色熒光(激發波長525 nm，發射波長590 nm)與綠色熒光(激發波長490 nm，發射波長530 nm)。計算紅色熒光數值/綠色熒光數值表示線粒體膜電位。

1.5 淋巴細胞mtDNA中8-氧鳥嘌呤脫氧核苷(8-oxodG)含量測定 按照試劑盒(Biovision)說明書提取并純化mtDNA。高效液相色譜法檢測mtDNA中8-oxodG含量。色譜柱采用粒徑為4 μm的C18反相柱(250 mm×4.6 mm)，流動相采用30 mmol氫氧化鈉，10 mmol醋酸，25 mM醋酸鈉，12.5 mM檸檬酸，6%甲醇，流速為0.8 ml/min，檢測波長260 nm。8-oxodG標準品制備標準應用液，上述條件下繪制標準曲線。計算樣品中8-oxodG含量(μg/ml)。

1.6 淋巴細胞mtDNA拷貝數測定 按照試劑盒(Biovision)說明書提取并純化細胞總DNA。采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測線粒體基因CytB及核基因18s rRNA的含量。引物序列：CytB上游，5′-CGGCTGACTAATCCGATACC-3′；下游，5′-TGGGAGTACATAGCCCATGA-3′。18s rRNA上游，5′-GGACCTGGAACTGGCAACAT-3′；下游：5′-GCCCTGAACTCTTTTGTGAAG-3′。RT-PCR采用SYB-R Green master mix 試劑盒(ABI)，反應參數：94 ℃/5 s，58 ℃/30 s，循環40次。計算CytB與18 s rRNA含量的比值確定淋巴細胞mtDNA 的相對拷貝數。

1.7 過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1(PGC-1α)蛋白表達 Western blot法檢測淋巴細胞PGC-1α蛋白表達量，以β-tubulin作為內參。垂直電泳儀上用10 μg提取蛋白樣品經15% SDS-PAGE分離，轉移致PVDF膜上。一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3次，再以1∶1000辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h，充分洗滌后，使用ECL試劑盒發光顯影，X線膠片壓片曝光，掃描定量各條帶相對灰度值。以平原組條帶灰度值為100%，其灰度值與平原組條帶灰度值的比值，即為其相對表達量(%)。

2 結 果

2.1 淋巴細胞線粒體膜電位及mtDNA中8-oxodG含量變化 與平原階段比較，移居高原3 d和7 d，線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量顯著升高(P<0.05)。與移居高原3 d比較，移居高原7 d和90 d，線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量顯著降低(P<0.05)。與移居高原7 d比較，移居高原90 d，線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)，mtDNA中8-oxodG含量顯著降低(P<0.05，圖1)。

2.2 淋巴細胞mtDNA拷貝數及PGC-1α蛋白表達的變化 與平原階段比較，移居高原3 d和7 d，mtDNA拷貝數及PGC-1α蛋白表達顯著升高(P<0.05)，移居高原90 d，mtDNA拷貝數及PGC-1α蛋白表達顯著降低(P<0.05)。移居高原90 d與移居高原3 d、7 d比較，mtDNA拷貝數及PGC-1α蛋白表達顯著降低(P<0.01)。見圖2。

圖1 高原習服進程中淋巴細胞線粒體膜電位及mtDNA中8-oxodG含量的變化

圖2 高原習服進程中淋巴細胞mtDNA拷貝數及PGC-1α蛋白表達的變化

3 討 論

線粒體氧化應激是低氧損傷的重要機制。前期研究發現，急性低氧暴露顯著增加線粒體電子漏，提高線粒體ROS生成速率[6]。mtDNA定位緊鄰呼吸鏈ROS生成位點，且缺乏組蛋白和修復酶等保護機制，極易受到ROS攻擊造成氧化損傷，mtDNA堿基被氧化修飾為8-oxodG。研究表明，如果DNA中8-oxodG不能有效清除，在復制過程中可引起G∶C-T∶A顛換突變；也可導致RNA聚合酶滑脫，在轉錄本中形成移碼突變[7]。Ballinger等[8]發現，用H2O2孵育人臍帶靜脈內皮細胞，可導致mtDNA氧化損傷，并伴隨由mtDNA編碼的13個復合體亞基mRNA表達均降低，線粒體氧化磷酸化效率降低。以上表明，mtDNA氧化損傷程度與單個線粒體健康程度及能量代謝水平呈負相關。

本研究中，久居平原武警新兵移居高原3 d和7 d后，mtDNA中8-oxodG含量明顯高于平原階段，但7 d較3 d mtDNA氧化損傷有所降低。Ferro等[9]也發現，貧血造成的低氧血癥可引起淋巴細胞ROS大量產生，導致mtDNA中8-oxodG含量增加，線粒體呼吸速率降低。Colleoni等[10]報道，人胎盤滋養層細胞低氧暴露4 d，mtDNA編碼的復合體Ⅰ亞基ND1、復合體Ⅳ亞基COX2以及ATP合成酶亞基ATP6的mRNA表達顯著降低。筆者利用細胞透膜的方法檢測了淋巴細胞內線粒體整體膜電位，發現線粒體整體能量輸出水平在移居高原3 d和7 d時明顯低于平原階段。總之，急進高原誘發的mtDNA氧化損傷是線粒體功能損傷的一個重要原因。

線粒體整體能量輸出水平受到單個線粒體能量代謝水平和線粒體數量的共同影響。為了代償低氧誘導的線粒體氧化損傷和能量代謝障礙，機體啟動線粒體生物合成，以促進mtDNA復制和轉錄，增加mtDNA拷貝數和線粒體數量。PGC-1α是調控線粒體生物合成的重要轉錄因子。Gutsaeva等[11]發現，短暫缺血可提高線粒體ROS產生，繼而通過活化p38 MAPK刺激PGC-1α介導的線粒體生物合成。本研究中，移居高原3 d和7 d，mtDNA拷貝數和PGC-1α蛋白表達明顯高于平原階段，而線粒體整體膜電位雖在第7天有所恢復，但仍低于平原階段。結果表明，在高原低氧習服初步階段，急性低氧活化PGC-1α通路增加線粒體數量，但mtDNA氧化損傷造成新生線粒體能量代謝障礙，而ROS產生增加，進一步加劇氧化損傷，形成惡性循環，因而無法完全恢復受損的能量供應。

本研究中，移居高原90 d，mtDNA氧化損傷較7 d進一步降低，mtDNA拷貝數及PGC-1α蛋白表達低于平原階段，而線粒體膜電位基本恢復至平原水平。Levett等[12]也發現平原人群移居高原19 d線粒體生物合成無明顯變化，而66 d時線粒體生物合成明顯降低。Gamboa等[13]證明，慢性低氧通過活化低氧誘導因子抑制PGC-1α介導的線粒體生物合成，但促進線粒體重分布于肌膜下，以提高毛細血管中氧向線粒體的擴散效率。本研究前期發現，慢性低氧可通過上調SIRT3提高線粒體呼吸速率，并增加線粒體抗氧化酶MnSOD和GPx活性[14]。筆者推測，隨著低氧暴露時間延長，線粒體發生一系列適應性變化，包括抗氧化及DNA修復能力提高，mtDNA氧化損傷降低，單個線粒體健康程度及能量代謝水平升高，足以恢復細胞能量供應，因而減少了對線粒體數量的依賴性，這也符合生物節省化原則。

高原習服的一個重要因素是提高線粒體氧利用和能量輸出效率，維持機體在低氧環境中的工作能力。本研究結果表明，高原低氧習服初期，淋巴細胞能量重構主要依賴于線粒體生物合成增加以提高線粒體數量，但不能完全恢復能量代謝水平；而在習服后期，淋巴細胞能量重構主要依賴于抑制mtDNA氧化損傷，提高單個線粒體健康程度及能量代謝水平，實現能量供應的完全習服。這為高原習服的評價及干預策略的開發提供了理論依據。

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(2014-01-26收稿 2014-05-20修回)

(責任編輯 郭 青)

ChangesincontentsofleukocytemitochondrialDNAandoxidativedamageduringacclimatizationtohighland

BO Hai1,2, GUO Fengchun3, DUAN Fuqiang4, PENG Peng1, and QIN Yongsheng1.

1.Department of Military Training Medicine; 2.Tianjin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury; 3.Department of Logistics Research, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China; 4.Department of Health, Tibet Autonomous Regional Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Lhasa 850000, China

ObjectiveTo study the changes in mitochondrial bioenergetics, mitochondrial DNA (mtDNA) and oxidative damage in leukocytes during acclimatization to highland hypoxia.MethodsTwenty-seven lowlanders quickly entered plateau. Leukocyte mitochondrial membrane potential, 8-oxodG in mtDNA, mtDNA copies and PGC-1α protein expression were measured in plain and plateau at 3 d，7 d，90 d after entry.ResultsAs compared with plain group, membrane potential was significantly decreased (P<0.05); 8-oxodG amounts, mtDNA copies and PGC-1α expression were markedly increased at 3 d and 7 d (P<0.05). And at 90 d, mtDNA copies and PGC-1α expression were significantly decreased (P<0.05). As compared with 7 d group, membrane potential was significantly increased (P<0.05); 8-oxodG amounts, mtDNA copies and PGC-1α expression were markedly decreased at 90 d (P<0.05).ConclusionsIn the early phase of acclimatization to highland, leukocyte bioenergetics remodeling mainly depends on increased mitochondrial content. In the later phase of acclimatization to highland, leukocyte bioenergetics remodeling mainly depends on elevated level of single mitochondrial health and energy metabolism.

acclimatization to high-altitude; leukocytes; mitochondrial DNA; copy number; oxidative stress

薄 海，博士，講師，E-mail：bohaixd@126.com

300309天津，武警后勤學院：1.軍事訓練醫學教研室，2.天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室，3.后勤工作研究所；4.850000拉薩，武警西藏總隊后勤部衛生處

秦永生，E-mail：qinyongshengwj@126.com

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