重慶地區兒童急性腹瀉相關博卡病毒的基因類型及其流行特征調查

趙 進，黃豆豆，李思思，郭辰濤，許紅梅，張小愛，劉 瑋

重慶地區兒童急性腹瀉相關博卡病毒的基因類型及其流行特征調查

趙 進1，黃豆豆1，李思思1，郭辰濤1，許紅梅2，張小愛1，劉 瑋1

目的了解重慶地區急性腹瀉患兒博卡病毒(human bocavirus, HBoV)的基因型和流行特征，為HBoV相關腹瀉的防控提供依據。方法以重慶醫科大學附屬兒童醫院為哨點醫院，收集2011年急性腹瀉兒童患者的糞便樣本504份，使用熒光定量PCR篩選陽性標本，使用巢氏PCR方法對陽性標本進行擴增，對擴增序列進行序列比對并建立進化樹進行基因分型。結果504份腹瀉標本中，49份為HBoV陽性，陽性率為9.72%。不同季節HBoV的檢出率不同，夏季檢出率(19.72%)最高(P=0.003)。序列比對和進化樹結果提示49份HBoV陽性標本中，HBoV1、HBoV2和HBoV3的例數分別25、23和1，其中檢出的23份HBoV2全部為HBoV-2B型。結論不同季節HBoV的檢出率不同，其中夏季病毒檢出率最高；重慶地區檢出的 HBoV以HBoV1型和HBoV2B型為主。

博卡病毒；急性兒童腹瀉；調查研究；基因型

人博卡病毒(human bocavirus, HBoV)屬于細小病毒科，是最近發現的可以引起人類急性胃腸炎的新發病原體[1]。HBoV無包膜，衣殼蛋白呈二十面體對稱，蛋白內包含一條長為5300 bp的線性單鏈DNA，主要編碼非結構蛋白NS1和NP1，結構蛋白VP1和VP2[2]。目前，國內缺乏重慶地區兒童急性腹瀉相關HBoV的研究[3-5]。本研究以重慶醫科大學附屬兒童醫院作為監測哨點醫院，對2011-01到2011-12急性腹瀉的兒童進行HBoV的調查研究，以了解重慶地區兒童腹瀉相關HBoV的型別及其流行特征。

1 材料和方法

1.1 病例定義 按照WHO對于急性腹瀉的定義納入研究對象：24 h內有3次及3次以上的水樣便或者稀便，腹瀉持續時間小于2周。同時排除炎性胃腸道疾病、脂泄病、囊胞性纖維病、食物中毒或者有明顯的呼吸系統癥狀和體征者[3]。

1.2 標本采集與檢測 符合納入標準的病例經知情同意后，采集患者急性期糞便標本。樣本使用PBS進行1∶10稀釋后取200 μl腹瀉稀釋液提取核酸。病毒核酸的提取使用QIAamp? MinElute? Virus Spin Kit (Cat.NO. 57704)試劑盒。熒光定量PCR篩選HBoV陽性標本，引物分別為HBoV1r和HBoV1f。陽性標本使用巢氏PCR擴增博卡病毒核酸長度為454 bp的NS1片段。第一輪引物為HBoV2-sf1 (AACAGATGGGCAAGCAGAAC) 和HBoV2-sr1 (AGGACAAAGGTCTCCAAGAGG)； 第二輪引物為HBoV2-sf2 (TGCTTCAACAGGCAAAACAA) 和 HBoV2-sr2 (TCCAAGAGGAAATGAGTTTGG)[6]。PCR擴增產物測序后進行BLAST序列比對，并從GenBank下載國內外HBoV的參考株序列，使用MEGA 5.1 建立進化樹，確定博卡病毒的基因型。

1.3 信息收集 使用標準調查問卷，由臨床醫師對符合納入標準的病例從病歷中抽取相關信息，主要包括患者年齡、性別、出生日期和發病日期。

1.4 統計學處理 數據錄入使用Epidata 3.0 錄入數據，建立腹瀉數據庫。數據分析使用SPSS17.0。不同組兒童之間HBoV檢出率的比較使用卡方檢驗或者Fisher檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 流行狀況 共收集腹瀉標本504份，其中49份為HBoV陽性，陽性率為9.72%。不同性別之間HBoV的檢出率無統計學差異(P=0.656)。不同年齡段之間HBoV的檢出率無統計學差異(P=0.280)。

不同季節的HBoV的檢出率不同，夏季HBoV的檢出率最高，秋季HBoV的檢出率最低(P=0.003，表1)。

2.2 病毒分型及其基因特征 根據BLAST比對和NS1核酸序列進化樹的結果(圖1)，檢測到的HBoV分為3型，HBoV1 和HBoV2最多，HBoV3最少，僅1株。重慶地區腹瀉HBoV1與呼吸道的HBoV1有很高的同源性(98%～100%)。檢測到HBoV2屬于HBoV-2B型，與FJ375129/Shanghai和FJ973559/Nigeria在進化樹上有很高的同源性。檢測到1株HBoV3型病毒，與病毒株JN086998/USA的同源性高達100%(表2)。

表1 2011年重慶地區HBoV感染兒童的性別、年齡和季節分布

圖1 2011年重慶地區HBoV感染NS1區核酸序列進化樹

表2 重慶地區不同HBoV基因型的檢出率和組內同源性

3 討 論

急性腹瀉是5歲以下兒童的常見疾病，具有很高的發病率和病死率。世界范圍內每年有超過7億5歲以下兒童發生急性腹瀉，超過200萬兒童死于急性腹瀉，占兒童死亡人數的19%[6- 8]。HBoV是最近發現的可以引起人類急性胃腸炎新發病原體，分為4個型，分別為HBoV1-4型，HBoV2型又進一步分為HBoV2A和HBoV2B兩個組[1,9,10]。HBoV1主要從呼吸道檢測出，HBoV2主要從糞便樣本中檢測出，HBoV3和HBoV4只是偶爾被檢測到[1,11]。 HBoV在世界范圍內腹瀉的檢出率為0.8%～25.6%[2-5,10,11]。我國首次于上海地區2008年腹瀉標本中檢測到HBoV2，其HBoV1和HBoV2的檢出率分別為5.3%和5.0%；我國首次從北京兒童醫院2006-2007年的腹瀉樣本檢測到兩株HBoV3，另外HBoV1、HBoV2和HBoV3的檢出率分別為2.5%、9.5%和0.5%。蘭州地區是HBoV2的高發地區，HBoV1、HBoV2和HBoV3的檢出率分別為4.3%、20.4%和0.9%；蘇州地區HBoV的檢出率為6.1%[3-5,10]。但是，尚缺乏重慶地區兒童急性腹瀉相關HBoV的研究。在本次監測中，重慶地區HBoV1、HBoV2和HBoV3的檢出率分別為4.96%，4.56%和0.20%，總HBoV的檢出率與上海地區相近，低于蘭州地區和北京地區[3-4,10]。重慶地區不同性別和年齡段腹瀉兒童的HBoV檢出率沒有差異。不同季節HBoV檢出率不同，夏季HBoV的檢出率最高，與廣州和蘇州地區調查研究報道的7～8月份為檢出率高峰基本一致[5]。

依據博卡病毒NS1片段建立進化樹，對HBoV進行基因分型。結果顯示，HBoV1和HBoV2B是腹瀉兒童患者最常見的基因型。HBoV1同組之間有很高的同源性，HBoV2同組之間也有很高的同源性，從同源性可以看出HBoV1和HBoV2的基因序列相對保守。重慶地區急性腹瀉樣本中，HBoV1是最主要的檢出基因型，與呼吸道檢出的HBoV1有很高的同源性(98.0%～100%)。HBoV2的檢出率僅低于HBoV1，在本研究中檢測到23株HBoV2全部屬于HBoV-2B型，并且與上海的FJ375129和尼日利亞的FJ973559有很高的同源性，而北京地區和蘇州地區的檢出的HBoV2為HBoV-2A型，提示不同地區的腹瀉患者感染的HBoV2型可能存在差異[3,5]。本研究同時還檢測到一株HBoV3，與美國的JN086998的同源性高達100%。

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(2014-06-04收稿 2014-07-08修回)

(責任編輯 武建虎)

InvestigationofhumanbocavirusinpediatricpatientswithacutediarrheainChongqing,China

ZHAO Jin1, HUANG Doudou1, LI Sisi1, GUO Chentao1, XU Hongmei2, ZHANG Xiaoai1, and LIU Wei1.

1. State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China; 2. Department of Infection Gastroenterology,Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China

ObjectiveTo investigate the prevalence, genotypes and epidemic characteristics of human bocavirus associated with acute pediatric diarrhea in Chongqing area.MethodsPediatric patients with acute diarrhea were recruited and stool samples were collected in Children’s Hospital of Chongqing Medical University during 2011. Real-time PCR and nested PCR were performed to determine the presence of HBoV and their genotypes.ResultsA total of 504 stool specimens were collected, from which 49 HBoV positive samples were identified, with a detection rate of 9.72%. A seasonal distribution of HBoV was observed, with a peak (19.72%) in summer. No distribution of age or gender specific was obtained for the HBoV positive detection. Based on Blast and MEGA analysis, 25 HBoV1, 23 HBoV2 and 1 HBoV3 were determined. All the HBoV2 strains detected belonged to HBoV-2B genotype.ConclusionsThe detection rate of HBoV has obvious seasonality, with a peak in summer. HBoV1 and HBoV-2B are the major genotypes.

human bocavirus; acute pediatric diarrhea; investigation; genotype

國家十二五傳染病重大專項 ( 2013ZX1004-202)，軍隊后勤科研基金課題(BWS11C073)

趙 進，碩士研究生，E-mail: phage1@163.com

1.100071北京，軍事醫學科學院微生物流行病研究所；2.400014，重慶醫科大學附屬兒童醫院

劉 瑋，E-mail: lwbime@163.com

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