大鼠服用丹酚酸B合用匹伐他汀后藥動學和肝細胞攝取能力的改變

肖 頻，魏筱華，盛向遠，鐘海利，鄒德琴，鄭雪蓮，彭洪薇，蔡 軍,溫金華

大鼠服用丹酚酸B合用匹伐他汀后藥動學和肝細胞攝取能力的改變

肖 頻1，魏筱華2，盛向遠2，鐘海利2，鄒德琴2，鄭雪蓮2，彭洪薇2，蔡 軍2,溫金華2

目的研究大鼠服用丹酚酸B合用匹伐他汀后藥動學及肝細胞攝取能力的改變。方法將SD雄性大鼠隨機分為兩組，每組6只，實驗一組單用丹酚酸B (2.5 g/kg)給藥；另一組丹酚酸B合用匹伐他汀(0.5 mg/kg)。兩藥合用時先丹酚酸B后匹伐他汀相繼灌胃，間隔15 min，眼球靜脈取血，探討有機陰離子轉運多肽 (organic anion transporting polypeptides, OATP)底物匹伐他汀對丹酚酸B的藥動學影響。然后，游離大鼠原代肝細胞，考察匹伐他汀對大鼠原代肝細胞攝取丹酚酸B的影響。結果丹酚酸合用匹伐他汀后，丹酚酸B的藥動學特性發生明顯變化，AUC(0-t)、AUC(0-∞)和Cmax分別增加了54.63%、69.72%、50.56%。隨著匹伐他汀濃度增加，其對大鼠原代肝細胞攝取丹酚酸B的抑制作用逐漸增強，IC50為(5.21±1.68)μmol/L。結論丹酚酸B肝臟轉運機制可能與OATP密切相關。

丹酚酸B；肝臟；轉運；匹伐他汀

丹酚酸B是丹參的有效水溶性成分，具有保護心肌、保護心臟、抗纖維化、抗腫瘤等多種藥理活性[1,2]。丹酚酸B在肝臟分布較廣[3]，但分布機制尚不明確。探明該機制對研究丹酚酸B的藥理學活性及其臨床應用具有較重要的意義。

有研究發現，維拉帕米(轉運蛋白抑制藥)在大鼠體內對丹酚酸的藥動學有明顯的影響：Cmax與AUC顯著增大，而清除率CL顯著降低[4]。由于維拉帕米可對藥物轉運體如P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、乳腺癌耐藥轉運體 (breast cancer resistance protein, BCRP)、有機陰離子轉運多肽 (organic anion transporting polypeptides, OATP)均具有抑制作用，因此，該研究提示丹酚酸B亦有可能是這些藥物轉運體的底物。有研究提示丹酚酸B在大鼠肝臟內的轉運可能與有OATP1B1(編碼基因SLCO1B1，是一種特異性分布于肝細胞基底膜上的一種轉運蛋白)密切相關[5-7]。本研究擬建立大鼠體內及大鼠原代肝細胞模型，以此為基礎探討丹酚酸B肝臟轉運的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 丹酚酸B，純度>98.0%，成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-13082008。匹伐他汀(內標)含量為95.6%，批號為0703001，廣東東陽光藥業有限公司。甲醇(高效液相色譜分析用)含量>99.9%，西隴化工股份有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，杭州四季青公司。Ⅳ型膠原酶，美國Gibco公司。

1.1.2 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，體重210～230 g，南昌大學實驗動物中心提供，動物生產合格證號SYXK(贛)2010-0002。

1.1.3 儀器 安捷倫Agilent-1260高效液相色譜儀；色譜柱(Agilent HC-C18，4.6 mm×150 mm, 5 μm)；上海飛鴿牌高速臺式冷凍離心機(GL-20G-Ⅱ)；METTLER TOLEDO 802電子天平；深圳市潔泰超聲清洗機JPS-20；美國渦旋震蕩儀Vortex-2；德國賀利氏CO2培養箱150； 日本Olympus CKX-41型倒置光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 甲醇∶水(200 ml+200 μl磷酸)=48∶52(v/v)，波長286 nm；柱溫35 ℃；流速1.0 ml/min，進樣量為20 μl。

1.2.2 樣本處理 100 μl血樣或細胞裂解液，加入10 μl 10%鹽酸，振蕩混勻；加入乙酸乙酯3.0 ml，渦旋振蕩1 min，離心10 min，去上層有機溶劑于30 ℃氮氣流吹干。加流動相60 μl 溶解，渦旋振蕩1 min，離心10 min，直接進樣40 μl。

1.2.3 分組及給藥 健康雄性 Wistar 大鼠12 只，禁食不禁水12 h，隨機分為兩組，每組6只，實驗時一組單用丹酚酸B (2.5 g/kg)給藥，另一組丹酚酸B合用匹伐他汀(0.5 mg/kg)。兩藥合用時先丹酚酸B后匹伐他汀相繼灌胃，間隔15 min，在灌胃給藥前0 h與給藥后0.15、0.3、0.5、1、1.5、2、 3、4、6 h 于眼底靜脈叢取血約0.25 ml，置肝素處理的Eppendorf 管中，3000 r/min, 離心10 min，分離血漿，置-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 大鼠肝細胞的分離提取 大鼠經5%戊巴比妥鈉(100 μl/100 g)尾靜脈麻醉并注射肝素1000 U/kg抗凝后，沿腹壁正中切開腹腔，門靜脈插管結扎，灌注37 ℃ 0.02%無鈣EDTA-PBS液(20～40 ml/min, 5～10 min)，直至下腔靜脈中流出的液體變清時，再用0.04% Ⅳ型膠原酶原位灌注(15～20 ml/min, 6 min)，至肝臟變軟腫大，壓之凹陷不易恢復。取出肝臟，去掉肝臟表面的包膜，在DMEM溫孵液中分離細胞，所得的肝細胞混懸液用DMEM溫孵液洗滌，低速離心分離后(500 r/min, 5 min)重復3次，獲得純化的肝細胞用含10%胎牛血清的DMED培養液重懸，制備成游離肝細胞懸液。

1.2.5 丹酚酸B的攝取動力學及溫度、濃度和pH值對攝取的影響 將用24孔板培養至良好狀態的肝細胞用37 ℃ 的Hank液浸泡20 min，除去細胞表面的雜質，加入37 ℃含丹酚酸B的Hank液1 ml，置37 ℃ 的培養箱中分別孵育10、30、60、90、120 min，取出后吸出藥液，以4 ℃空白Hank’s液沖洗3遍，加入“三蒸水”1 ml，反復凍融3次，破碎細胞，制成細胞溶液，處理后進行檢測。溫度的影響：改為在4 ℃冰箱中孵育，分別孵育10、20、30、40、60、90 min，其余操作同上。藥物濃度的影響：對肝細胞分別給予含丹酚酸B 0.25×10-3、0.5×10-3、1×10-3、2×10-3、4× 10-3、8×10-3、16×10-3mmol /L的Hank液1 ml，置37 ℃的培養箱中孵育120 min，其余操作同上。pH的影響：對肝細胞分別給予不同pH (6.0、6.5、7.0、7.5) 的丹酚酸B(1×10- 3mol/L)的Hank液1 ml，置37 ℃的培養箱中孵育120 min，其余操作同上。

1.2.6 細胞懸液蛋白質的測定 采用考馬斯亮蘭法測定細胞懸液中蛋白質的含量, 細胞懸液取樣量為50 μl。

1.2.7 匹伐他汀對原代肝細胞攝取丹酚酸B的影響 用DMEM培養液將肝細胞懸液稀釋為1×106/ml，加入到24孔培養板內，每孔2 ml。實驗分為空白組、丹酚酸B對照組及丹酚酸B加系列濃度匹伐他汀組；加入20 μl對應的藥物稀釋液，使丹酚酸B終濃度為4 mmol/L，匹伐他汀終濃度分別為10、20、40 μmol；每組設4個復孔。置37 ℃的培養箱中分別孵肓40 s，定時緩慢吸棄細胞上層培養液，加入4 ℃PBS液洗滌4次后加入0.5 ml無菌水于-80 ℃超低溫冰箱反復凍融3次。取細胞破碎液100 μl按“樣本處理”操作后進行分析。

1.3 統計學處理 實驗數據采用DAS2.1藥動學軟件的非房室模型法分析(統計矩法)進行藥動學參數計算。藥動學參數間的比較運用SPSS12.0軟件采用配對t檢驗。用MINIIC50軟件計算丹酚酸B對匹伐他汀在原代肝細胞的攝取抑制參數IC50。

2 結 果

2.1 大鼠肝細胞形態學特征 單用丹酚酸B大鼠原代肝細胞呈條索狀或圓塊狀，細胞透亮，邊界清楚，胞質豐富，泡漿內有許多小顆粒，可見空泡，細胞核中等大小，圓形或橢圓形，核多偏位，可見雙核甚至多核，以單核多見(圖1A)。丹酚酸B合用匹伐他汀大鼠原代肝細胞形態均一，大多數細胞呈單個分散狀態，也呈現小小的細胞團。隨著細胞培養時間延長，細胞貼壁，伸展，變薄，體積明顯變大，部分細胞呈多邊形展開，有些細胞呈島狀連接(圖1B)。

圖1 倒置顯微鏡下大鼠原代肝細胞 (HE，×400)

2.2 匹伐他汀對丹酚酸B的藥動學影響 丹酚酸B合用匹伐他汀后，丹酚酸B的藥動學特性發生明顯變化，AUC(0-t)、AUC(0-∞)和Cmax均明顯增加，均值分別增加了54.63%、69.72%、50.56%；且合用后丹酚酸B的半衰期亦增加，與單用丹酚酸B比較，呈現統計學差異(表1)。達峰時間并未呈現統計方面的差別(圖2)。

2.3 丹酚酸B的攝取動力學 肝細胞對丹酚酸B的攝取在30 min基本達到平衡，此后攝取量趨于飽和，在4 ℃ 時，肝細胞攝取量為(13.38±4.75)μg/mg protein，而37℃ 時為(8.36±2.35)μg/mg protein，可見隨著溫度升高攝取量反而減少，差別有統計學意義(P<0.05)。在pH=7.5時，肝細胞攝取量為(10.89±3.86)μg/mg protein，在pH=6時，則為(14.38±5.06)μg/mg protein，后者高于前者，差異有統計學意義(P<0.05)。肝細胞對丹酚酸B的攝取量與給藥濃度呈正比，當濃度為 8×10-3mmol/L達到飽和現象(圖3)。

參數單用丹酚酸B丹酚酸B合用匹伐他汀PAUC(0?t)2．05±0．243．17±0．300．0002AUC(0?∞)2．25±0．253．53±0．400．0003t1/20．89±141．14±0．140．0390Tmax0．47±0．080．43±0．100．6101Cmax1．78±0．272．68±0．310．0002

圖2 灌服匹伐他汀前后丹酚酸B的平均藥時曲線下面積

圖3 丹酚酸B在大鼠肝細胞中的攝取

2.4 匹伐他汀對原肝細胞攝取丹酚酸B的影響 單用丹酚酸B時，肝細胞攝取丹酚酸B為(14.36±0.83)μg/mg protein，而當加用2、5、10 μmol 匹伐他汀時，攝取能力降低，依次為(10.83±1.07)、(7.65±0.89)、(5.96±0.67)μg/mg protein，與單用丹酚酸B比較，差別均有統計學意義(P<0.01)。IC50為(5.21±1.68)μmol/L。

3 討 論

目前，國內外對丹酚酸B的研究主要集中于其分離、提取、鑒定和藥理學效應，而對丹酚酸B在體內藥物轉運機制的研究甚少。進入體內后丹酚酸的分布如下心>肝>肺>腸>腎>脾>胃[3]。丹酚酸B在大鼠體內主要通過肝臟甲基化代謝成活性代謝產物M1 (3-甲基-丹酚酸B ) ，M2(3,3?-二甲基-丹酚酸B ) ，M3( 3,3″,3?-三甲基-丹酚酸B ) ，M4(3,3″-二甲基-丹酚酸B)[7]。目前，肝臟內對丹酚酸B的攝取機制尚不明確。筆者前期研究發現，丹參素在大鼠體內可顯著影響瑞舒伐他汀的藥動學[5]，并且該影響與丹參素在肝臟競爭抑制OATP1B1介導的瑞舒伐他汀的轉運密切相關[5]。丹酚酸B與丹參素均是丹參水溶性成分，有研究顯示丹參素是丹酚酸B在大鼠體內的代謝成分[6,7]。本研究通過整體動物及肝細胞兩方面來初步探討丹酚酸B肝臟轉運機制。

本研究結果表明，匹伐他汀可以明顯影響丹酚酸B在大鼠體內的藥動學，但由于體內影響因素諸多，尚不能明確具體的原因。匹伐他汀在肝臟亦具有較高的藥物濃度，可以說后者是其作用的主要靶器官，因此，隨后主要圍繞大鼠肝細胞進行相關研究，并發現匹伐他汀對肝細胞攝取丹酚酸B表現出明顯的抑制作用。由于匹伐他汀主要通過OATP1B1攝取進入肝細胞，匹伐他汀是OATP1B1的底物[8,9]，因此丹酚酸B亦有可能是OATP1B1的底物，從而引發底物的競爭，導致匹伐他汀對肝細胞攝取丹酚酸B的影響。由于肝細胞上其他轉運體如BCRP、NTCP、MRP等均有表達[10]，因此，丹酚酸B肝臟攝取的相關研究需進一步探討。

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(2014-04-12收稿 2014-05-17修回)

(責任編輯 武建虎)

InvivoPharmacokineticsofsalvianolicacidBcombinedwithpitavastatinanduptakingofsalvianolicacidBinhepatocytesofrats

XIAO Pin1, WEI Xiahua2, SHENG Xiangyuan2, ZHONG Haili2, ZOU Deqin2, ZHENG Xuelian2, PENG Hongwei2, CAI Jun2，and WEN Jinhua2.

1. Department of Pharmacy，Jiangxi Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Nanchang 330000，China 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006，China

ObjectiveTo study the pharmacokinetics of salvianolic acid B combined with pitavastatin and the uptaking of salvianolic acid B in rat hepatocytes.MethodsSD male rats were randomly divided into two groups (n=6).One group was given salvianolic acid B 2.5 g/kg and another group was given salvianolic acid B combined with pitavastatin 0.5 mg/kg. For combined administration, the salvianolic acid B was first gavaged and then pitavastatin. Interval time lasted about 15 min. Blood samples were collected from the orbital vein. The effect of OATP1B1 substrate of pitavastatin on the pharmacokinetics of salvianolic acid B in rats was examined. Then the primary rat hepatocytes were separated, the effect of pitavastatin on the hepatocytes uptaking of salvianolic acid B was studied.ResultsThe pharmacokinetic characteristics of salvianolic acid B significantly changed when salvianolic acid B was combined with pitavastatin, the parameters of AUC (0-t), AUC (0- ∞) and Cmax were significantly increased by 54.63%, 69.72%, and 50.56%. Simulatneously, the inhibitory action for uptaking of salvianolic acid B in rat hepatocytes increased gradually with increasing pitavastatin concentration. The IC50was (5.21±1.68) μmol.ConclusionsThe uptaking of salvianolic acid B in hepatocytes may be closely related to OATP.

salvianolic acid B；hepatocytes；transport；pitavastatin

江西省衛生廳中醫藥科研計劃課題(2012A137)

肖 頻，本科學歷，副主任藥師，E-mail: zpchen_5500@126.com

1.330000南昌，武警江西總隊醫院藥劑科；2. 330006,南昌大學第一附屬醫院藥劑科

溫金華，E-mail:wenjh866@163.com

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