多索茶堿對體外U937細胞增殖與誘導凋亡的影響

王燁珣，何 娟

多索茶堿對體外U937細胞增殖與誘導凋亡的影響

王燁珣1，2，何 娟1

目的探討磷酸二酯酶抑制藥多索茶堿對體外培養的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細胞U937增殖及凋亡的影響。方法分別將不同實驗濃度的多索茶堿作用于一定濃度的處于對數生長期的U937細胞，采用WST-1方法檢測細胞增殖抑制率，TUNEL法檢測細胞凋亡。結果不同濃度的多索茶堿分別作用于U937細胞后，細胞增殖活性受抑程度隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加而逐漸增加(P<0.01)，其中以60 mg/L組最明顯。不同濃度的多索茶堿均能促進U937細胞凋亡，且凋亡具有顯著的濃度依賴性及時間依賴性(P<0.01)。結論多索茶堿能夠抑制白血病細胞U937細胞株增殖，誘導其凋亡，并具有濃度及時間依賴性。

多索茶堿；髓系白血病；U937細胞；細胞增殖與凋亡

誘導細胞凋亡是一些化療藥物殺滅白血病細胞的主要機制[1-3]。多索茶堿屬于磷酸二酯酶抑制藥(PDE)，國內外均有研究提示茶堿類藥物有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[4-7]。本研究擬將多索茶堿作用于U937細胞，觀察對其增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 多索茶堿(開封康諾藥業公司生產，應用時配至實驗所需濃度)；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，一抗。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒及FITC綠色熒光標記。光學顯微鏡，酶聯免疫檢測儀。數碼顯微鏡(OLYMPUS BX41型)，生物顯微鏡(CHA型)，Leica Q550CW圖象采集和分析系統(德國萊卡公司)，微量移液器。脫水機(LEICA300型)，石蠟包埋機(EG1150型)，切片機(LEICA RM2235型)。

1.2 細胞系及細胞培養 人-粒單核性白血病細胞株U937購自中國醫科大學血液室，將購入后的U-937細胞置于培養液常規飼養，每日更換新鮮培養液，隔日傳代。實驗對象為對數生長期的細胞。

培養液配置：無菌的RPMI1640培養液500 ml，加入胎牛血清(無菌 ，去除支原體)50 ml，加入青霉素濃度為10 000 U/ml和鏈霉素濃度為10 mg/ml的混合液5 ml。混勻后，分裝至100 ml的試劑瓶中，4 ℃冰箱中冷藏保存備用。

1.3 WST-1法檢測多索茶堿對細胞增殖活性的影響 取對數生長期細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養液調整細胞濃度為(3～5)×104/ml，將待測細胞吹勻后接種于96孔板，每孔90 μl，然后分別加入多索茶堿液10 μl，其實驗終濃度分別設5.0、10.0、15.0、30.0、60.0 mg/L，另設空白對照孔。每個濃度設定10個復孔，空白對照組只加含10%小牛血清的RPMI1640，將各組分別在培養箱中常規培養12 h及24 h。取出培養后的培養板，每孔加WST-1溶液10 μl混勻，37 ℃再培養2 h，將培養板取出，在酶聯免疫檢測儀上選擇450 nm和 620 nm波長，分別測定每孔的吸光度值，相減后得到調整后的OD450，再用無細胞孔校正。

1.4 TUNEL法檢測多索茶堿對細胞凋亡的影響 (1)培養步驟同上，取細胞對數生長期細胞，進行藥物干預,以5×104/ml的細胞濃度接種于瓶內，分別加入多索茶堿溶液500 μl，其實驗終濃度分別設為10.0、20.0、30.0 mg/L，對照組不加，各組分別于培養12 h及24 h時分別收集細胞制備涂片用于凋亡檢測。(2)將固定好的細胞涂片以下述流程處理：PBS漂洗兩次，樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本加50 μl TdT酶反應溶液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤反應60 min(TdT酶反應溶液：45 μl Equilibration Buffer+1μl FITC-12-dUTP+4 μl TdT Enzyme,需新鮮配制)，陰性對照片不加TdT酶，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡檢測：激發波450～500 nm ,發射波長515～565 nm(綠)。(3)熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態，結果判斷：在清晰的背景上細胞呈黃綠色為陽性。每張片子連續選取5個互不重疊的視野，計數每個視野中的陽性細胞數，以平均數記為該片陽性細胞凋亡數。

2 結 果

2.1 多索茶堿對U937細胞的增殖抑制作用 空白對照組細胞增殖活性(OD值)為0.404±0.016，不同濃度的多索茶堿分別作用于U937細胞12 h及24 h后，細胞增殖活性受抑程度隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加而逐漸增加(P<0.01)，其中以60 mg/L作用24 h組最明顯(表1)。

表1 多索茶堿濃度、作用時間與細胞增殖活性(OD值)檢測結果的關系 (n=10；

2.2 多索茶堿對U937細胞凋亡的影響 WST-1法與TUNEL法所觀察結果一致，空白對照組凋亡陽性細胞數為(7.8±1.3)個，3組不同濃度的多索茶堿作用12 h及24 h均能促進U937細胞凋亡，且凋亡具有顯著的濃度依賴性(P<0.01)及時間依賴性(P<0.01)，見表2。凋亡檢測結果見圖1。

表2 多索茶堿濃度、作用時間與細胞凋亡檢測結果的關系 (n=5；

圖1 多索茶堿作用后電鏡下細胞凋亡狀況(FITC，×200倍)

3 討 論

近年來,隨著聯合化療的應用及有效化療方案的不斷改進和完善，成人急性白血病的完全緩解率可達70%以上，但其長期生存率只有10%～40%[1，2]。研究表明, 各種白血病的發生及其對治療的反應可能均和白血病細胞凋亡的減少有關，這也成為如何通過誘導白血病細胞的凋亡來治療白血病的重要著力點。Li等[3]在對白血病細胞系的研究中發現，白血病細胞的增殖與凋亡在病理狀態下穩定在一定比例上, 如何破壞這種比例加速白血病細胞凋亡將成為篩選和尋找新的化療藥物的重點。近年來國內外均有研究提示，茶堿類藥物有誘導細胞凋亡的作用。如Binet等[4]發現氨茶堿能誘導慢性淋巴細胞白血病患者B淋巴細胞凋亡；劉澤林等[5]報道磷酸二酯酶抑制藥對淋巴瘤細胞有生長抑制及誘導細胞凋亡作用；趙蘭濱等[6]報道氨茶堿誘導白血病K562細胞凋亡；羅亞玲等[7]報道氨茶堿能誘導人氣管平滑肌細胞凋亡。多索茶堿亦屬于茶堿類藥物，其對腫瘤細胞的作用未見相關報道。

磷酸二酯酶抑制藥多索茶堿是第二信使分子(cAMP)環核苷酸信號滅活的關鍵酶，可調控體內cAMP濃度，進一步激活其效應分子蛋白激酶A(PKA)，降低細胞生長的速度，抑制細胞的增殖，同時還可通過激活核酸內切酶誘導細胞凋亡[8]。多索茶堿還具有增加兒茶酚胺，調節鈣流及拮抗腺苷受體作用[9]，鈣離子同屬細胞內信息傳遞的第二信使，能夠通過鈣離子蛋白受體CaM調整cAMP代謝，促進細胞內的cAMP累積而進入cAMP-PKA通路，誘導細胞凋亡。除此以外，茶堿類藥物還可通過下調bcl-2[10],上調p53[11]及fas[12]誘導細胞凋亡。

本實驗結果表明，不同濃度的多索茶堿分別作用于U937細胞12 h及24 h后，細胞增殖活性受抑程度及凋亡隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加而呈現明顯的濃度依賴性及時間依賴性。多索茶堿是目前臨床應用比較成熟的藥物，其不良反應及機體的耐受能力均遠優于氨茶堿，兼具經濟性和安全性，本實驗結果提示該藥可以作為白血病治療的輔助藥物，并為其他類似藥物作用的拓展研究提供思路。

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(2014-03-22收稿 2014-05-05修回)

(責任編輯 尤偉杰)

DoxofyllineinhibitesU937cellsproliferationandinducesapoptosisinvitro

WANG Yexun1,2and HE Juan1.

1.Department of Hematology,The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China; 2. Department of Medicine, Liaoning Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Shenyang 110034, China

ObjectiveTo study the effects of the inhibitors of phosphodiesterase for acute myeloid leukemiainvitroculture U937 cell proliferation and apoptosis ,and provide basis for the clinical adjuvant treatment of leukemia.MethodsAdd Doxofylline of different experimental concentrations was added respectively to a certain concentration of U937 cells in ogarithmic phase. Cell proliferation rate was detected by WST-1 method and the apoptosis by TUNEL method.ResultsDifferent concentrations of doxofylline acted on U937 cells respectively. The degree of inhibition of cell proliferative activity gradually increased with prolonged action time and the increase of drug concentration(P<0.01), the most obvious among them was in 60 mg/L group. Different concentrations of doxofylline promoted U937 cell apoptosis and apoptosis with significant concentration dependence and time dependence(P<0.01).ConclusionsConfirmed by the experiment, doxo fylline can inhibit leukemia U937 cell line proliferation and induce its apoptosis,and has concentration dependence and time dependence.

doxofylline; acute myeloid leukemia; U937 cells; apoptosis and inhibition

王燁珣，碩士，主治醫師,E-mail: wang-y-x@163.com

1.110001沈陽，中國醫科大學附屬第一醫院血液科；2.110034沈陽，武警遼寧總隊醫院門診部

何 娟，E-mail：hejuan 2006@aliiun.com

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