反向、巢式、降落PCR技術克隆奧尼羅非魚MSTN基因3′側翼序列

2014-07-18 05:17:53李景芬采克俊曹訪孫君艷梅楊玲

江蘇農業科學 2014年2期

李景芬+采克俊+曹訪+孫君艷+梅楊玲

摘要：為獲得奧尼羅非魚側翼MSTN基因的3′未知序列以完成奧尼羅非魚MSTN基因全序列的克隆，采用反向、巢式、降落等3種PCR 技術對該未知序列進行克隆，對克隆到的序列進行測序，并與已有的奧尼羅非魚MSTN基因核苷酸序列進行比對，獲得MSTN基因3′端1 376 bp 新序列，從而完成奧尼羅非魚MSTN基因全序列的克隆，為奧尼羅非魚MSTN基因功能的進一步研究以及奧尼羅非魚的分子育種研究奠定基礎。說明反向、巢式、降落PCR相結合是擴增已知基因側翼序列行之有效的方法。

關鍵詞：反向PCR；巢式PCR；降落PCR；奧尼羅非魚；MSTN基因；3′側翼序列

中圖分類號： S917文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0028-03

收稿日期：2013-07-05

基金項目：浙江省自然科學基金（編號：Y3110432、Y3090561）；浙江省錢江人才計劃（編號：2012R10076 ）；浙江省公益性技術應用研究計劃（編號：2011C37078）；浙江省重點創新團隊項目（編號：2012R10026-05）。

作者簡介：李景芬（1977—），女，浙江湖州人，博士，主要從事分子生物學方面的研究。E-mail：lijingfen@hutc.zj.cn。奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O.aureus）為奧利亞羅非魚父本同尼羅羅非魚母本雜交獲得的良種，雄性率高，生長速度快，群體產量高，且抗病力強。因其肉白、富彈性、刺少而被稱為“白色三文魚”，是聯合國糧農組織向世界各國推薦養殖的優良水產品之一，也是全球旺銷的水產品之一[1]。肌肉生長抑制素（MSTN，簡稱抑肌素）基因是轉錄生長因子β（TGF-β）家族的一個成員，最先在小鼠中發現[2]，并且已有研究證明該基因是哺乳動物骨骼肌生長發育的負調控因子。有研究表明，該基因的功能在魚與哺乳動物上一致，即均可抑制骨骼肌生長，如轉基因斑馬魚因MSTN被抑制而使肌纖維數量明顯增加[3]；通過RNA干擾沉默MSTN基因的斑馬魚表現出體型巨大化[4]；MSTN基因顯性失活形式的過表達導致轉基因青鳉的肌纖維數量在成年后加倍[5]；青鳉MSTN基因的缺失，在幼魚后期到成魚初期表現為肌纖維數量的增加，隨后出現肌纖維的肥大，呈現“雙肌”表型[6]。因此，筆者選擇反向、巢式、降落3種PCR技術克隆奧尼羅非魚MSTN基因的3′側翼序列，以有效獲得這一未知序列，完成奧尼羅非魚MSTN基因全序列的克隆，從而為研究奧尼羅非魚MSTN基因功能和分子育種奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試的奧尼羅非魚由浙江省淡水水產研究所提供。限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ、HindⅢ，T4 DNA連接酶，rTaq DNA 聚合酶，dNTP，DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖、大腸桿菌DH5α及質粒載體pMD19-T vector均購自TaKaRa 公司。AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep 質粒小量制備試劑盒、AxyPrep PCR Clean-up kit 均購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。此外，還有EDTA、苯酚、三氯甲烷、異戊醇等。

1.2試驗方法

1.2.1DNA的提取采用經典的苯酚-三氯甲烷法提取魚血DNA。2.0 μL DNA 樣品進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，再結合紫外分光光度計法檢測所提取的DNA 的重量和濃度。

1.2.2DNA的酶切參照限制性內切酶說明書進行酶切試驗，分別采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、XbaⅠ 等6 種限制性內切酶對基因組DNA 進行酶切，酶切反應總體積為40 μL，37 ℃水浴酶切18 h。用電泳檢測酶切效果，之后用AxyPrep PCR Clean-up kit 進行純化，用20 μL ddH2O洗脫以去除限制性內切酶。

1.2.3酶切片段的連接與酶切片段的連接環化參照T4 DNA 連接酶說明書進行連接，反應體系為100 mL[包括 82 μL ddH2O、10 μL T4 DNA Ligase Buffer、6 μL 酶切產物（>50 ng/μL）和2 μL T4 DNA 連接酶]，16 ℃連接21 h，再用AxY PrepTM PCR Clean up kit 進行純化，以10 μL ddH2O 洗脫，獲得5個酶切庫。

1.2.4引物設計與PCR 擴增已克隆到的奧尼羅非魚MSTN基因序列設計引物，由上海英駿公司合成。反向、巢式PCR第1輪引物： 1S為5′-CTTCTTCCCTGTTGTCATCTCCCAGCAC-3′，1A為5′ -CTACCCACTCACTGTGGACTTCGAGGAC-3′；第2輪引物：2S為5′-TCGTACTGATCCAGAAGCTGCTGCA-3′，2A為5′-CCCCAACAAAGATGTCGCCAATCAA-3′。引物1S和1A分別以各酶切庫為模板進行第1輪反向、巢式、降落PCR，PCR體系 50 mL 包括10 PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 4 μL、10 pmol/μL 1S 4 μL；10 pmol/μL 1A 4 μL、25 ng/μL 模板 2 μL、5 U/μL rTaq 0.4 μL、ddH2O 30.6 μL。擴增程序：95 ℃ 預變性4 min；95 ℃ 變性30 s，73、71、69、67、65、63、61 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸3 min，每個退火溫度均如此循環3次；95 ℃變性30 s；55 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃延伸 10 min。PCR結束后電泳。

對PCR產物進行30倍稀釋，以稀釋后的PCR產物為第2輪PCR的模版，PCR體系、程序同第1輪，只是引物為2S、2A，模版為4 μL，ddH2O 28.6 μL。PCR結束后電泳。

1.2.5PCR產物克隆與測序用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收和純化PCR 擴增的目的片段。將純化的DNA 片段與pMD-19T Vector連接，構建重組質粒，轉化感受態大腸桿菌DH5α，PCR 法篩選重組子，搖勻，用AxyPrep質粒小量制備試劑盒提取質粒，雙酶切（BamHⅠ、HindⅢ）鑒定正確后送往上海英駿公司測序。

1.2.6序列分析采用DNAman 軟件進行序列分析，與GenBank 數據庫的相關序列進行核苷酸序列同源性比較。

2結果與分析

2.1奧尼羅非魚MSTN基因3′側翼序列的擴增與克隆

基因組DNA分別采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和XbaⅠ進行酶切，結果見圖1。由圖1可知，X泳道的基因組沒切開，應舍棄；其余酶切較好，從上到下可看見彌散的條帶，分別純化后連接作為PCR的模板庫。第1輪反向、巢式、降落PCR 擴增結果見圖2，未獲得特異性的PCR條帶。第2輪反向、巢式、降落PCR 擴增結果見圖3，從BglⅡ庫中擴增到約1 450 bp的特異性條帶，從NcoⅠ庫中擴增出約 960 bp 的特異性目的條帶，而從BamHⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ庫中均未擴增出特異性目的條帶。將所獲得的2條特異性目的條帶進行克隆測序，將測序所獲得的序列與已有的奧尼羅非魚MSTN基因序列進行核苷酸序列比對，獲得3′端1 376 bp 新序列。

2.2奧尼羅非魚MSTN基因新獲得序列分析

將所獲得的新序列在網上進行在線Blast分析，該新序列與莫桑比克羅非魚的MSTN基因序列相似度為99%，與點帶石斑魚和加州鱸的MSTN基因序列相似度為85%，與尼羅尖吻鱸的MSTN基因序列相似度為81%。目前已經得到了奧尼羅非魚MSTN基因的全部序列，并已提交給GenBank，序列號為KC583258。

3結論與討論

反向PCR技術是由Ochman等研究開發的[7-8]，主要用

于擴增與已知DNA序列相臨的未知DNA序列。對含有已知序列及其相鄰未知序列的基因組DNA樣品用一種在已知序列中無酶切位點的限制性內切酶進行酶切，再用T4 DNA連接酶使酶切片段連接環化，之后以環化的DNA庫為模板，用一對與已知序列兩端特異性結合的引物向夾在中間的未知序列部分進行擴增。該方法在很多研究中都有應用[7-12]，本研究利用該方法也成功得到了奧尼羅非魚MSTN基因3′端 1 376 bp 的未知序列。

巢式PCR在醫學檢測和分子生物學方面研究應用較多[13-16]。該方法的原理是設計2對引物，第1次PCR采用能擴增較大片段的引物，擴增結束后，采用能擴增較小片段的引物，以第1次擴增的產物為模板進行第2次擴增，以增強擴增的特異性。本研究設計了2對引物，先用擴增較大片段的引物進行擴增，結果如圖2所示，未擴增到單一的目的條帶；再用擴增較小片段的引物以第1次擴增產物為模板進行第2次擴增，結果如圖3所示，得到了非常單一、特異性的目的條帶，達到了試驗的目的。由此可見，巢式PCR能有效獲得特異性目的片段。

降落PCR是一種多循環PCR，其原理是：隨循環數增加，退火溫度逐漸降低，當退火溫度低于解鏈溫度（Tm≈10 ℃）時，則固定于該退火溫度進行擴增，從而達到最佳擴增效果[17-18]。起始退火溫度可高于Tm（約為5 ℃），然后每個循環降低1～2 ℃或每幾個循環降低1～2 ℃，直到退火溫度低于Tm（約為10 ℃）。盡管退火溫度最終降低到非特異性雜交的Tm，但此時目的擴增產物已開始幾何擴增，在剩余循環中超過任何非特異性產物的擴增量。雖然降落 PCR 程序復雜，但能非常有效地降低或避免假陽性[19]，尤其對那些不了解的引物和目的模版匹配程度，比如在用簡并引物進行擴增時，筆者就曾經利用降落PCR、簡并引物順利克隆了草魚的PKR基因[20]。對于Tm 相近的PCR反應可在同一循環條件下進行，可大大提高工作效率[21]。對不確定退火溫度基因的擴增而言，這是首選[22]。由此可見，降落PCR在基因克隆上有較強的優勢，可用于普通PCR難以擴增的基因片段。反向PCR結合巢式PCR在低拷貝甚至是單拷貝基因的側翼序列克隆時，可顯示其較好的特異性和靈敏度[23]。本試驗聯合使用這3種PCR，有效獲得了奧尼羅非魚MSTN基因的3′側翼這一未知序列，完成了奧尼羅非魚MSTN基因全序列的克隆。

從本試驗順利成功的實施可以看出，反向、巢式、降落PCR相結合是擴增已知基因側翼序列行之有效的方法。如只采用反向PCR（圖2）不能獲得目的條帶，但結合巢式PCR就得到了特異性目的條帶。但反向、巢式PCR相結合，用普通的PCR程序進行擴增，本研究沒有擴增到到任何條帶，而在此基礎上采用降落PCR后擴增到了目的條帶，說明3種PCR技術相結合可有效獲得目的條帶，提高效率。另外，該方法比較經濟，避免了使用RACE法的高昂費用。筆者計算過該方法涉及到的試劑費用約需2 500元，而完成該試驗每種試劑只用了一點點；而RACE法只1個10次的3′RACE試劑盒就2 000元左右。再者，該方法操作嚴格度低，雖然步驟繁瑣，但都是在DNA上進行的，操作嚴格度相對寬松；而RACE法的對象是RNA，操作與DNA相比相對比較嚴格。由此可見，反向、巢式和降落PCR技術相結合是克隆已知基因旁側序列經濟、有效并可廣泛使用的好方法，為科研工作者提供了克隆已知基因旁側序列的新途徑。

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