紅掌FLOWERING LOCUS T同源基因的克隆及生物信息學分析

馬廣瑩+鄒清成+劉慧春+周江華+朱開元

摘要：通過高通量測序技術獲得紅掌成花素基因FT，對其進行序列分析，通過與已報道同源基因的比較，預測基因FT能夠顯著促進轉基因植物開花，為開展紅掌分子育種提供了有益基因資源。

關鍵詞：紅掌；克隆；基因FT；信息學；序列分析

中圖分類號： S682.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0031-02

收稿日期：2013-06-18

基金項目：國家自然科學基金（編號：31200527）；浙江省自然科學基金（編號：Q13C150011）。

作者簡介：馬廣瑩（1982—），男，山東梁山人，博士，助理研究員，從事園林植物引種栽培及遺傳育種工作。E-mail：magypetunia@aliyun.com。為實現種群繁衍，植物必須在合適的時間進行生殖生長、開花結果。許多植物調整開花時間的方式是根據環境信號（如日照長短、溫度等）來產生應答反應，植物內源激素和年齡這2個內部信號也可以誘導植物開花。近年來，通過對模式植物擬南芥的分子水平研究，人們總結出“光周期、春化、自主調控以及赤霉素”4條控制植物開花的途徑[1-3]。FLOWERING LOCUS T基因（FT基因）是學術界普遍認可的成花素，于葉片中合成，然后通過韌皮部運輸到頂端分生組織，FT與FD基因互作，誘導下游成花基因的表達，促進開花[4-5]。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在6類FT-like基因，都可能參與了成花誘導，這些基因有著共同的PEPB結構域[6]。本研究經轉錄組測序，克隆到了1個紅掌（Anthurium andraeanum）PEPB基因，通過序列對比等生物信息學分析，確定該基因是1種促進開花的功能基因，這為今后通過轉基因手段培育矮化的早花紅掌品種、縮短紅掌育種年限提供了重要的資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

紅掌品種為“阿拉巴馬”，取盛花期植株幼嫩葉片、苞片、花序3個組織進行混合，按照美國Invitrogen公司生產的植物RNA提取試劑盒（貨號：12322-012）提取總RNA，構建Illumina文庫，并委托上海美吉生物公司采用Illumina Hiseq 2000對文庫進行測序。

1.2序列分析軟件及分析方法

通過測序獲得的基因序列，經過NCBI 網站ORFFinder軟件進行編碼區預測，然后用http：//prosite.expasy.org/網站進行編碼區氨基酸序列預測，并進行序列保守結構域的檢索[7]，采用DNAMAN軟件進行多序列氨基酸比對，采用MEGA5進行多物種FT基因進化關系分析[8]，建樹方法為Neighbor-joining，bootstrap 1 000次。

2結果與分析

2.1紅掌FT基因獲得

通過測序，獲得了與水稻FT基因相似度較高的1條EST序列，通過比對分析，初步確定其為紅掌FLOWERING LOCUS T基因的同源物，命名為AaFT。如圖1所示，該基因編碼區核苷酸序列有525 bp，其余部分為UTR區域。用該區域序列進行氨基酸推測，得到了174個氨基酸殘基。

2.2AaFT基因生物信息學分析

通過在線軟件分析，不僅推測出該基因的氨基酸序列，還找到了該序列中存在PBP結構域所在的位置，該結構域共計23個氨基酸殘基，序列為YTLVMVDPDAPSPSDPNLREYLH，起始位置為64～86號氨基酸。

為了更好地分析該基因的保守性及與同類基因的相似度，將其與擬南芥FT基因（AtFT）進行序列比較。由圖2可見，擬南芥與紅掌FT基因的序列相似度比較高，二者在FT基因關鍵氨基酸殘基上有著相同的組成，即第85、140號氨基酸殘基分別為酪氨酸、谷酰胺。

用MEGA軟件構建了6種不同物種FT基因的進化樹。從圖3可見，單、雙子葉植物FT基因同源性差異明顯，屬于單子葉植物的紅掌與水稻（Oryza sativa，登錄號：AB052943.1）、蕙蘭（Cymbidium faberi，登錄號：KC138734.1）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrid，登錄號：KC138805.1）、小麥（Triticum aestivum，登錄號：AY705794.1）親緣關系較近，聚類時容易聚在一起，而紅掌FT基因與擬南芥相比，親緣關系則明顯較遠，這也與二者分屬單、雙子葉植物類別相對應。

3小結與討論

FT基因作為成花素，受到廣泛關注，目前，已經有非常多植物的FT基因被成功克隆出來，在促進植物開花方面表現十分優異[9]。紅掌作為國內外重要的高檔盆栽花卉，目前育種工作主要集中在常規雜交育種方面，分子育種剛剛起步，紅掌FT基因的克隆為通過轉基因手段快速培育紅掌新品系、縮短雜交育種年限提供了有利條件，也為微型紅掌品種的開發提供了可能。

本試驗通過高通量測序技術獲得了1條包含完整編碼框的FT基因序列，通過比對及生物信息學分析，確定該基因為紅掌FT同源基因。前人研究證明，FT基因家族存在著序列高度相似、功能完全相反的成員——TFL[10-11]，但是二者在關鍵氨基酸組成上存在著明顯區別，通過比較分析，本研究所克隆的基因序列在85號及140號氨基酸組成上與擬南芥促進早花的FT基因完全一致，結合相似序列，確定該基因是FT基因，其功能應該是促進植物開花，而非抑制植物開花。

用紅掌FT基因與擬南芥比較，雖然二者分屬于單、雙子葉植物類別，但是兩基因在氨基酸組成的高度相似說明了FT基因在進化過程中保持著穩定性，這可能是其發揮早花功能的必備條件。與多物種FT基因進行聚類分析，發現紅掌FT基因與其他單子葉植物之間存在著較大遺傳距離，說明FT基因雖然功能上保持著穩定性，但隨著物種的進化而不斷發生變異，深入研究該基因及其家族成員，有利于解析不同物種的進化模式。

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