epiregulin 在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

郭 曉，葛兮源，王衣祥，傅 嘉，李盛林，3

epiregulin在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

郭 曉1，2，葛兮源1，3，王衣祥1，3，傅 嘉1，3，李盛林1，2，3

目的探討表皮生長因子epiregulin在涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)肺轉移中的作用。方法SACC石蠟組織標本30例。通過免疫組織化學方法(SP方法)檢測epiregulin 在SACC石蠟組織標本中的表達，并分析其與臨床病理特征之間的關系。結果(1)Epiregulin廣泛地表達于細胞質或細胞核。(2)SACC發(fā)生肺轉移15例，陽性著色率86.7%(13/15)，H-score(Hs)定量分析平均為1.26±0.65；未發(fā)生肺轉移15例，陽性著色率33.3%(5/15)，Hs為0.48±0.25。與Ⅰ+Ⅱ期相比，epiregulin在SACC Ⅲ+Ⅳ期表達顯著升高。(3)Kaplan-Miere 生存曲線分析未發(fā)現(xiàn)epiregulin的表達與SACC患者的預后相關。結論Epiregulin的表達與涎腺腺樣囊性癌肺轉移有一定相關性，但仍需要大樣本研究進一步證明。

涎腺腺樣囊性癌；肺轉移；表皮調節(jié)素

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是發(fā)生在大小唾液腺中最常見的惡性腫瘤之一，在所有唾液腺惡性腫瘤中占22%～24%[1-3]。其生物學行為特殊，嗜神經(jīng)侵襲性強，易發(fā)生血行轉移，遠處轉移率可高達40%[4, 5]，肺是最主要的轉移部位。盡管SACC短期預后好，但其遠期生存率較差。遠處轉移是主要死亡原因之一。epiregulin是表皮生長因子家族的成員之一。有研究發(fā)現(xiàn)，epiregulin在一些類型的腫瘤組織中高表達，如大腸癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和人口腔鱗狀細胞癌[6-14]。前期affymetrix U133人類基因芯片的研究發(fā)現(xiàn)，與SACC低肺轉移潛能細胞系SACC-83細胞相比，epiregulin的mRNA表達水平在高肺轉移潛能細胞系SACC-LM細胞中上調了4.55倍[15]。 此外，外源性的epiregulin可以促進SACC-83細胞的體外遷移和侵襲能力[15]。但是，epiregulin在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達及其與肺轉移的關系還不清楚。本研究旨在探討epiregulin的表達與SACC肺轉移及其他臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 病例及組織標本 選取2001-01至2003-12在北京大學口腔醫(yī)院頜面外科就診并診斷為SACC 30例，男12例，女18例。隨訪結束于2013-05-04，之后對臨床資料進行回顧性整理和分析。發(fā)病年齡17～70歲，中位年齡40.75歲，平均隨訪期限102.9個月。由高年資病理醫(yī)師按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)的TNM方法(2002版本)對患者的病理診斷進行確認。X線片檢查明確是否發(fā)生肺轉移。在本研究設立的隨訪時限內，若觀察到肺轉移，則定義為肺轉移組(15例)；若未觀察到肺轉移，則定義為未轉移組(15例)。

1.2 免疫組織化學及半定量評估 組織切片(4 μm 厚)在二甲苯中脫蠟，75%乙醇中水化。切片在0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中進行抗原熱修復，3%過氧化氫處理去除內源性過氧化物酶活性，孵育10%胎牛血清阻止非特異性結合。組織切片PBS漂洗，加epiregulin (1∶200, R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 一抗4 ℃孵育過夜，IgG為對照。隨后孵育生物素標記后的二抗(中衫金橋生物技術有限公司，北京)。蘇木精復染，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)鏡下顯色。通過H-score(Hs)對染色強度進行半定量分析，Hs=∑(Pi×i)/100, Pi是著色細胞的百分比(胞核或胞質)，i是著色強度 (0、1、2或3)。評分選取40×高倍鏡下隨機3個視野，由兩個評分人獨立評分。設置Hs=0.5為臨界點[16]，將epiregulin的半定量表達轉換成二分類變量，即低表達組(Hs≤0.5)及高表達組(Hs>0.5)，比較兩組的預后。

2 結 果

2.1 epiregulin的表達 30例中，有18例epiregulin的表達呈陽性，表達率為60.0%，主要在細胞核或細胞質中表達(圖1)。其中，Epiregulin在轉移組中的陽性著色率為86.7%(13/15)，在未轉移組中為33.3%(5/15)。轉移組epiregulin平均Hs為1.26±0.65，未轉移組Hs為0.48±0.25，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 人涎腺腺樣囊性癌組織epiregulin的表達 (DAB染色，×40)

2.2 epiregulin的表達與臨床病理特征之間的關系 epiregulin表達與年齡、部位、組織分型、周圍神經(jīng)浸潤等臨床病理特征無統(tǒng)計學關聯(lián)，而與性別、肺轉移和臨床分期有統(tǒng)計學關聯(lián)(表1)。

2.3 epiregulin的表達與預后的關系 Kaplan-Miere生存曲線(圖2)及Log-Rank檢驗未發(fā)現(xiàn)epiregulin的表達與患者的生存期相關(P=0.336)。

3 討 論

3.1 epiregulin表達與人類腫瘤 SACC是以遠處轉移為特征的涎腺惡性腫瘤，以肺部轉移為主。腫瘤轉移機制盡管研究的很廣泛，如從表觀遺傳學的角度[17]、緊密連接的角度[18]及MicroRNA的角度[19]等，但其發(fā)病機制仍然不詳。尋找能夠預測SACC轉移的生物標志物將有助于提高患者生存率。epiregulin在健康人組織中表達極低，主要在外周血巨噬細胞和胎盤組織中。而在人的一些腫瘤組織中epiregulin的表達增高，且與腫瘤的生物學特性相關，如膀胱癌、非小細胞肺癌、肺癌、大腸癌等，成為人們探討腫瘤生物標志物的熱點。Zhang等[12]報道，在人非小細胞肺癌中epiregulin主要表達于細胞質，而Sunaga與Sun等[13，20]報道在人非小細胞肺癌組織中細胞核與細胞質均有表達。本研究首次明確了在人的涎腺腺樣囊性癌組織中，epiregulin廣泛地表達于細胞核或細胞質。

表1 epiregulin 在SACC組織中的表達及其與臨床病理特征的關系 ±s)

圖2 epiregulin的Keplan-Miere生存分析曲線Log-Rank檢驗未發(fā)現(xiàn)兩組有生存差異,P=0.479

3.2 epiregulin的表達與轉移的關系 在人大腸癌的研究中[21]，epiregulin的表達與腫瘤浸潤的深度及遠處轉移相關；在人非小細胞肺癌中[12]，epiregulin高表達與淋巴結轉移及縮短的生存時間相關，且可以作為肺腺癌的獨立預后指標[13]。在小鼠的乳腺癌細胞實驗模型中，Ereg基因(編碼epiregulin)被發(fā)現(xiàn)能與Cox2，Mmp1和Mmp2協(xié)同促進腫瘤生長、血管生長和肺轉移[22]。目前積累的證據(jù)提示epiregulin在一些腫瘤中具有促進遷徙和侵襲的作用。在本研究中，肺轉移組的組織標本中epiregulin的表達明顯高于未轉移組，且epiregulin高表達與肺轉移相關，提示epiregulin可能在SACC肺轉移過程中發(fā)揮作用。

3.3 epiregulin的表達與臨床分期和患者生存的關系 Th?gersen等[8]的研究提示，epiregulin mRNA的表達水平在T2到T4期膀胱癌腫瘤組織中顯著高于Ta期(腫瘤局限在膀胱的內襯上皮層)，而且其高表達與患者的生存緊密相關。但在本研究中，只發(fā)現(xiàn)臨床Ⅲ+Ⅳ期患者epiregulin表達高于Ⅰ+Ⅱ期，卻未發(fā)現(xiàn)epiregulin的表達與患者的生存時間相關。其原因可能與SACC組織的多形性有關，或者還需要尋找更多的相關指標聯(lián)合進行預后相關性判斷。Sunaga等[13]報道，在非小細胞肺癌中，epiregulin高表達組的生存時間與epiregulin低表達組的生存時間差異呈弱陽性(P=0.058)。當將epiregulin表達與KRAS突變聯(lián)合分析時發(fā)現(xiàn)，epiregulin高表達且KRAS突變組的生存時間與epiregulin低表達且KRAS野生型組有統(tǒng)計學差異。另外，本研究的樣本量可能不具有優(yōu)勢。因此，擴大研究樣本量以進一步驗證上述研究結果十分必要。

[1] Chummun S, McLean N R, Kelly C G,etal. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck[J]. Br J Plast Surg, 2001, 54(6): 476-480.

[2] Wiseman S M, Popat S R, Rigual N R,etal. Adenoid cystic carcinoa of the paranasal sinuses or nasal cavity: a 40-year review of 35 cases[J]. Ear Nose Throat J, 2002, 81(8): 510-517.

[3] 邱蔚六. 口腔頜面外科理論與實際[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：741.

[4] 吳運堂，趙燕平，趙福運，等. 口腔頜面部惡性腫瘤肺轉移(70例報告分析)[J]. 中華口腔醫(yī)學雜志, 1989, 24(3): 130-133.

[5] Dodd R L, Slevin N J. Salivary gland adenoid cystic carcinoma: a review of chemotherapy and molecular therapies[J]. Oral Oncol, 2006, 42(8): 759-769.

[6] Toyoda H, Komurasaki T, Uchida D,etal. Distribution of mRNA for human epiregulin, a differentially expressed member of the epidermal growth factor family[J]. Biochem J, 1997, 326(Pt 1): 69-75.

[7] Zhu Z W, Kleeff J, Friess H,etal. Epiregulin is up-regulated in pancreatic cancer and stimulates pancreatic cancer cell growth[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 273(3): 1019-1024.

[8] Th?gersen V B, S?rensen B S, Poulsen S S,etal. A subclass of HER1 ligands are prognostic markers for survival in bladder cancer patients[J]. Cancer Res, 2001, 61(16): 6227-6233.

[9] Nicholson B E, Frierson H F, Conaway M R,etal. Profiling the evolution of human metastatic bladder cancer[J]. Cancer Res, 2004, 64(21): 7813-7821.

[10] Fujimoto N, Wislez M, Zhang J,etal. High expression of ErbB family members and their ligands in lung adenocarcinomas that are sensitive to inhibition of epidermal growth factor receptor[J]. Cancer Res, 2005, 65(24): 11478-11485.

[11] Révillion F, Lhotellier V, Hornez L,etal. ErbB/HER ligands in human breast cancer, and relationships with their receptors, the bio-pathological features and prognosis[J]. Ann Oncol, 2008, 19(1): 73-80.

[12] Zhang J, Iwanaga K, Choi K C,etal. Intratumoral epiregulin is a marker of advanced disease in non-small cell lung cancer patients and confers invasive properties on EGFR-mutant cells[J]. Cancer Prev Res, 2008, 1(3): 201-207.

[13] Sunaga N, Kaira K, Imai H,etal. Oncogenic KRAS-induced epiregulin overexpression contributes to aggressive phenotype and is a promising therapeutic target in non-small-cell lung cancer[J]. Oncogene, 2012, 32: 4034-4042.

[14] Shigeishi H, Higashikawa K, Hiraoka M,etal. Expression of epiregulin, a novel epidermal growth factor ligand associated with prognosis in human oral squamous cell carcinomas[J]. Oncol Rep, 2008, 19(6):1557-1564.

[15] Hu K, Li S L, Gan Y H,etal. Epiregulin promotes migration and invasion of salivary adenoid cystic carcinoma cell line SACC-83 through activation of ERK and Akt[J]. Oral Oncol, 2009, 45(2): 156-163.

[16] Ling D, Wang Y X, Li S L,etal. TGF-β1 Promotes Migration and Invasion of Salivary Adenoid Cystic Carcinoma[J]. J Dent Res, 2011, 90(6):804-809.

[17] Challagundla K B, Wise P, Fabbri M. Role of MicroRNAs in Cancer Epigenetics[M]//Epigenetics and Cancer. Netherlands: Springer, 2013: 13-31.

[18] Lane J, Martin T A, Jiang W G. The ROCK Signalling Pathway and Tight Junctions [M]//Tight Junctions in Cancer Metastasis. Netherlands: Springer, 2013: 291-301.

[19] Taylor M A, Sossey-Alaoui K, Thompson C L,etal. TGF-β upregulates miR-181a expression to promote breast cancer metastasis[J]. J Clin Invest, 2013, 123(1): 150-163.

[20] Sun M, Behrens C, Feng L,etal. HER family receptor abnormalities in Lung cancer brain metastases and corresponding primary tumors [J]. Clin Cancer Res, 2009, 15: 4829-4237.

[21] Li X D, Miao S Y, Wang G L,etal. Amphiregulin and epiregulin expression in colorectal carcinoma and the correlation with clinicopathological characteristics[J]. Onkologie, 2010, 33(7): 353-358.

[22] Gupta G P, Nguyen D X, Chiang A C,etal. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis[J]. Nature, 2007, 446(7137): 765-770.

(2013-12-20收稿 2014-03-06修回)

(責任編輯 武建虎)

Expressionofepiregulinintissueofsalivaryadenoidcysticcarcinomaanditsrelationshipwithclinicopathologicalcharacteristics

GUO Xiao1，2, GE Xiyuan1，3, WANG Yixiang1，3, FU Jia1，3, and LI Shenglin1，2，3. 1. Central Laboratory，2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, 3. Laboratory of Oral and Maxillofacial Surgery, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081，China

ObjectiveTo study the role of epiregulin, a member of epidermal growth factor (EGF) family, in the metastasis of salivary adenoid cystic carcinoma (SACC) cell.MethodsThirty paraffin-embeded archival tissue samples were used to examine epiregulin expression in SACC tissue by immunohistochemistry SP methods. Its relationship with clinicopathological characteristics were analyzed afterwards.Results(1)Epiregulin expressed broadly in cytoplasm or nuclear compartments. (2)The epiregulin positive stain rate in lung metastasis-group (15 cases) was 86.7%(13/15), its average H-score is 1.26±0.65, whereas for non-metastasis group, the positive stain rate was 33.3%(5/15), and H-score was 0.48±0.25 on average. Epiregulin expressed higher in stage Ⅲ and Ⅳ than in clinical stages of Ⅰand Ⅱ. (3)No correlation was found between epiregulin expression and survival.ConclusionsEpiregulin expression may be associated with SACC lung metastasis. Studies of large sample size to further confirm the findings of this pilot study is warranted.

salivary adenoid cystic carcinoma/SACC; lung metastasis;ereg/epiregulin

國家自然科學基金(81272967)

郭 曉，碩士研究生在讀，E-mail:xjcarrie@sina.com

100081，北京大學口腔醫(yī)院：1.中心實驗室, 2.口腔頜面外科；3.100081，北京大學口腔醫(yī)學院口腔頜面外科研究室

李盛林，E-mail:kqshlli@bjmu.edu.cn

R739.87