蓖麻毒蛋白在蓖麻組培苗不同部位葉片中含量的測定

羅蕊+趙志強+黃鳳蘭等

摘要：本研究優化了從蓖麻葉片中提取蛋白的過程，利用硫酸鹽沉淀法、BCA試劑盒、UVwin5紫外軟件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結合的方法對蓖麻組培苗不同部位葉片中的毒蛋白的含量進行測定，結果表明，蓖麻葉片中毒蛋白的含量與葉位呈正比。

關鍵詞：蓖麻；蓖麻毒蛋白；含量；葉位；硫酸鹽沉淀法

中圖分類號： S565.601文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0043-03

收稿日期：2013-05-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：30760123、31060194）；國家民族事務委員會項目（編號：10NM02）；內蒙古自然科學基金（編號：2010BS0511）；內蒙古人才基金。

作者簡介：羅蕊（1988—），女，內蒙古扎蘭屯人，碩士研究生，主要從事植物基因工程研究。E-mail：luorui19880629@163.com。

通信作者：陳永勝，博士，教授，主要從事植物基因工程研究工作。E-mail：chenys-2012@hotmail.com。蓖麻（Ricinus communis L.），大戟科，世界十大油料作物之一[1]，具有很高的應用價值[2-5]。蓖麻中有毒的物質主要包括蓖麻堿、蓖麻毒蛋白、變應原、血球凝集素這4種物質，都具有很大的毒性。蓖麻毒蛋白是一種蛋白分解酶，是由毒類素、全毒素、凝集素這3種物質組成的蛋白質[6]，其相對分子量為64 000左右，也有報道為36 000～85 000。蓖麻毒素（ricin）為白色粉末狀或結晶狀，無味，不溶于有機溶劑，在飽和的硫酸銨溶液中能沉淀析出。蓖麻毒蛋白由A、B 2條鏈組成。A鏈是效應鏈，是一種具有N-糖苷酶活性的多肽；B鏈有凝集素的活性，能與細胞上的半乳糖的糖蛋白結合[7]。蓖麻提取物具有殺蟲的特性，適用于開發生物農藥。曾有人對蓖麻不同部位蓖麻堿的含量進行測定[8]，但至今國內還沒有人測定過蓖麻不同時期葉片中毒蛋白的含量。本試驗采用硫酸銨沉淀法、BCA蛋白試劑盒法、UVwin5紫外軟件v5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結合的方法，對蓖麻毒蛋白在蓖麻不同部位葉片中含量進行簡單、快速、精確的分析測定，為研究蓖麻毒蛋白在植株各部位的含量分析奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

植物材料為通蓖5號蓖麻組織培養苗，由內蒙古民族大學蓖麻工程研究中心提供。

1.2儀器與試劑

Hema冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；紫外可見分光光度計-T6新世紀（北京普析通用儀器有限責任公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；BandScan蛋白定量分析軟件。

1.3試驗方法

1.3.1 蓖麻粗蛋白的提取參照曾佑煒等的方法[9]，對每1 g葉片中磷酸緩沖液的加入量和PEG的分子質量進行優化，同時對比冷藏葉片和新鮮葉片的提取效果，從而確定試驗方法。取3株蓖麻組織培養苗，稱取約1 g蓖麻不同部位的葉片，在液氮中充分研磨；按照1 g葉片加入10 mL 5mmol/L磷酸緩沖液（PBS，pH值6.5，含100 mmol/L NaCl，稱為緩沖液A）的比例加入，并充分混勻；4 ℃放置過夜；4 ℃下17 000 r/min離心30 min，小心去除沉淀和白色脂肪；重復離心1次，取上清；在上清中加入固體（NH4）2SO4，達到60%飽和度；4 ℃放置 3 h；4 ℃下17 000 r/min離心30 min；倒去上清，把沉淀溶解在緩沖液A中；裝入透析袋（截留分子量：8 000～14 000），用PEG（分子量20 000）包埋后4 ℃透析3 h；4 ℃下 17 000 r/min 離心30 min，取上清即為毒蛋白粗品，記錄所得的粗蛋白的體積，并設置3個重復。

1.3.2蓖麻粗蛋白含量的測定

1.3.2.1蛋白質標準曲線的制作標準曲線制作的操作步驟參照北京莊盟國際生物基因科技有限公司BCA蛋白定量試劑盒說明，得到濃度計算公式：C=k1×D562 nm+k0，其中：k0=-0.080 91，k1=0.982 79，D562 nm為波長為562 nm處吸光度，相關性為0.999 7。

1.3.2.2粗蛋白濃度測定取一定量粗蛋白，稀釋100倍后測D562 nm，并根據蛋白標準曲線公式計算稀釋100倍后粗蛋白的濃度μg/μL）。粗蛋白濃度C（μg/μL）=（k1×稀釋100倍后的D562 nm+k0）×100。

1.3.2.3粗蛋白含量的計算根據粗蛋白的濃度、粗蛋白的體積和每個樣品中提取粗蛋白時葉片的重量，計算出每1 g葉片粗蛋白的含量。粗蛋白含量（mg）=稀釋100倍后濃度（μg/μL）×粗蛋白體積（mL）。1 g葉片粗蛋白含量（mg/g）=葉片中粗蛋白含量（mg）/葉片重量（g）。

1.3.3蓖麻毒蛋白含量的測定

1.3.3.1粗蛋白的SDS-PAGE電泳用12%的膠進行SDS-PAGE電泳，每個點樣孔上樣量為30 μL。

1.3.3.2蛋白條帶灰度比重分析具體操作步驟參見BandScan軟件操作說明。得到每個品種中每種蛋白質占粗蛋白的灰度百分比。

1.3.3.3毒蛋白含量計算根據BandScan軟件分析毒蛋白占粗蛋白灰度百分比和每1 g葉片中粗蛋白含量，計算每1 g葉子中毒蛋白的含量。每1 g葉子中毒蛋白的含量（mg/g）=每1 g葉片粗蛋白含量（mg/g）×毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比。

2結果與分析

2.1蛋白標準曲線的制作

利用BCA法繪制的蛋白質標準曲線見圖1。從圖1可以看出，所制作的蛋白質標準曲線質量較好。

2.2蓖麻粗蛋白含量的測定

對3株蓖麻粗蛋白含量的測定結果見表1。

從表1可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳

3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結果見圖2。從圖2可以看出，毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近，在電泳圖中2條帶有重疊的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析軟件對3個植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結果進行分析，得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每個葉片的條帶數不同，所以毒蛋白在分析時不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小，電泳過程中有些出現2條帶重疊現象，導致軟件分析時，被認為是1條帶，但不影響軟件的最后分析結果。

對3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。

由表1和圖3可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量計算

對3株蓖麻中毒蛋白的含量計算結果見表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根據表1求出每個葉片中含有毒蛋白的平均含量，結果見表2。

由圖4可以看出，不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。

3結論與討論

從總體上看，蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。

蓖麻提取物中的主要殺蟲物物質為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿，蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用，蓖麻堿則主要具有觸殺胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農藥具有很好的前景。在條件優化過程中發現，經冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量，葉片在冷凍過程中毒蛋白會降解；老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量，隨著葉片中粗纖維的增加，蛋白質總量減少，同時毒蛋白的含量也減少。

蓖麻籽主要用于榨油，經高溫處理后，蓖麻中的主要毒性物質只有變性原和蓖麻堿，餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田，利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對蓖麻的充分利用，減少資源浪費，有助于開發新型生物農藥，本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎，有利于農藥開發的后續研究。

參考文獻：

[1]張寶賢，譚德云，劉紅光，等. 我國蓖麻產業發展及其能源化利用的探討[J]. 農業科技通訊，2010（1）：22-23.

[2]潘國才，丁愛華.蓖麻的綜合利用現狀[J]. 農業科技與裝備，2009（1）：1-2，5.

[3]蘇雅拉圖. 蓖麻抗生育研究進展[J]. 內蒙古民族大學學報：自然科學版，2011，26（3）：316-319.

[4]張紅菊，趙懷勇. 蓖麻對鹽漬土的改良效果研究[J]. 中國水土保持，2010（7）：43-44，66.

[5]張智勇，陳永勝，倪娜，等. 蓖麻產品在農藥中的應用及研究進展[J]. 內蒙古農業科技，2011（6）：74-76.

[6]趙青余，桂榮，那日蘇.蓖麻餅脫毒的研究進展[J]. 飼料工業，2002，23（11）：35-39.

[7]孫媚華，陳遷，宋光泉，等. 蓖麻毒蛋白的研究與應用[J]. 廣東化工，2009，36（9）：144-145，162.

[8]溫燕梅，馮亞非，鄭明珠.蓖麻不同部位殺蟲活性成分蓖麻堿的提取及含量[J]. 農藥，2008，47（8）：584-585，606.

[9]曾佑煒，宋光泉，彭永宏，等. 蓖麻毒蛋白的分離純化和毒理作用研究[J]. 中國農學通報，2004，20（4）：23-25，32.

[10]趙建興，張樹懷，佘國珍，等. 蓖麻毒素粗提物殺蟲作用的研究[J]. 內蒙古農業大學學報：自然科學版，2001，22（4）：78-80.

2.2蓖麻粗蛋白含量的測定

對3株蓖麻粗蛋白含量的測定結果見表1。

從表1可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳

3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結果見圖2。從圖2可以看出，毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近，在電泳圖中2條帶有重疊的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析軟件對3個植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結果進行分析，得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每個葉片的條帶數不同，所以毒蛋白在分析時不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小，電泳過程中有些出現2條帶重疊現象，導致軟件分析時，被認為是1條帶，但不影響軟件的最后分析結果。

對3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。

由表1和圖3可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量計算

對3株蓖麻中毒蛋白的含量計算結果見表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根據表1求出每個葉片中含有毒蛋白的平均含量，結果見表2。

由圖4可以看出，不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。

3結論與討論

從總體上看，蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。

蓖麻提取物中的主要殺蟲物物質為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿，蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用，蓖麻堿則主要具有觸殺胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農藥具有很好的前景。在條件優化過程中發現，經冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量，葉片在冷凍過程中毒蛋白會降解；老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量，隨著葉片中粗纖維的增加，蛋白質總量減少，同時毒蛋白的含量也減少。

蓖麻籽主要用于榨油，經高溫處理后，蓖麻中的主要毒性物質只有變性原和蓖麻堿，餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田，利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對蓖麻的充分利用，減少資源浪費，有助于開發新型生物農藥，本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎，有利于農藥開發的后續研究。

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2.2蓖麻粗蛋白含量的測定

對3株蓖麻粗蛋白含量的測定結果見表1。

從表1可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳

3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結果見圖2。從圖2可以看出，毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近，在電泳圖中2條帶有重疊的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析軟件對3個植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結果進行分析，得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每個葉片的條帶數不同，所以毒蛋白在分析時不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小，電泳過程中有些出現2條帶重疊現象，導致軟件分析時，被認為是1條帶，但不影響軟件的最后分析結果。

對3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。

由表1和圖3可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量計算

對3株蓖麻中毒蛋白的含量計算結果見表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根據表1求出每個葉片中含有毒蛋白的平均含量，結果見表2。

由圖4可以看出，不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。

3結論與討論

從總體上看，蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。

蓖麻提取物中的主要殺蟲物物質為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿，蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用，蓖麻堿則主要具有觸殺胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農藥具有很好的前景。在條件優化過程中發現，經冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量，葉片在冷凍過程中毒蛋白會降解；老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量，隨著葉片中粗纖維的增加，蛋白質總量減少，同時毒蛋白的含量也減少。

蓖麻籽主要用于榨油，經高溫處理后，蓖麻中的主要毒性物質只有變性原和蓖麻堿，餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田，利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對蓖麻的充分利用，減少資源浪費，有助于開發新型生物農藥，本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎，有利于農藥開發的后續研究。

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