熒光染色法研究茄子花粉母細胞減數分裂及其雄配子體發育

唐紅艷+崔群香+韓長奎+閆素芹+王倩+劉衛東

摘要：應用H33258熒光染色法研究茄子花粉母細胞減數分裂、雄配子體發育過程。結果表明：茄子花粉母細胞中胞質分裂方式為同時型；成熟花粉粒為2-細胞型，包括1個營養核、1個精細胞；減數分裂中期Ⅰ可觀察到12個二價體，小孢子有絲分裂中期可觀察到12條染色體，是染色體計數的最佳時期；四分體排列方式有平面型、四面體型，四分體細胞體積可作為單核中晚期小孢子的間接比較標準。

關鍵詞：茄子；花粉母細胞；減數分裂；雄配子體發育

中圖分類號： S641.101文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0107-03

收稿日期：2013-06-06

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（11）1005]。

作者簡介：唐紅艷（1990—），女，江蘇泗陽人，主要從事蔬菜種子繁育工作。

通信作者：崔群香，博士，副教授，從事園藝作物遺傳育種教學和科研工作。E-mail：cqx@jit.edu. cn。茄子（Solanum melongena L.）是茄科茄屬的重要蔬菜，染色體數2n=24。茄子主要病害有黃萎病、褐紋病、青枯病、早疫病、病毒病、綿疫病等，以黃萎病危害最重。茄子近緣野生種含有多種優良抗病基因，通過遠緣雜交創制新型異染色體系材料，開展染色體工程育種已成為茄子抗病育種的突破口[1]。因此，開展細胞、分子遺傳學研究對于茄子染色體工程育種具有重要意義。了解花粉母細胞中染色體的構型、比例及其動態變化，準確識別花粉母細胞減數分裂特征，是研究栽培茄與其野生種染色體互作的前提，也有利于提高各種異染色體系材料的創制效率[2]。觀察雄配子體的發育過程，有利于確定花蕾形態與雄配子體發育階段之間的關系，提高花藥、小孢子培養時供體材料花蕾選取的準確性。目前關于茄子的細胞學研究主要集中在染色體核型分析[3-4]以及減數分裂上[5]，雄配子體發育研究很少。花粉母細胞減數分裂研究中常用的方法包括改良苯酚品紅法（卡寶品紅）、蘇木精染色法、壓片觀察技術，雄配子體發育需要結合使用染色、冬青油透明技術[6]。熒光染色結合透明技術用于觀察染色體較小的不結球白菜二倍體、四倍體[7-8]，已應用于南瓜、向日葵等作物上[9-10]，但未見其應用于茄子減數分裂、雄配子體發育研究。本研究利用熒光染色法研究茄子減數分裂、雄配子體發育，以便快速確定植株染色體數目、配子體發育階段，旨在為茄子分子生物學研究提供快捷有效的方法。

1材料與方法

1.1材料

供試茄子品種為滬茄四號，2011年11月上旬溫室育苗，2012年3月中旬定植于連棟棚內，4月中旬晴天10：00左右取不同大小的花蕾，用自封袋放入冰盒帶回實驗室，4 ℃冰箱中放置24 h，然后將花蕾分成4個級別：（1）花萼未開及花萼剛張開，花瓣距花萼筒>2 mm；（2）花萼張開，花瓣距花萼筒≤2 mm；（3）花萼張開，花瓣超過花萼筒0～2 mm；（4）花瓣超過花萼筒2 mm以上。

1.2方法

將上述4個級別的花蕾剝去萼片挑出花藥，分別用卡諾固定液進行固定，經95%、85%、70%、50%、30%梯度乙醇和蒸餾水各浸泡沖洗20 min，然后轉入pH值為5.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中放置24 h以上。25 ℃黑暗條件下，用20 μg/L H33258染色數小時并過夜。搗碎花藥并吸取含花粉母細胞或雄配子體的碎片，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕按壓，用Nikon80i熒光顯微鏡在紫外激發的熒光下觀察、統計并拍照。

2結果與分析

2.1花粉母細胞減數分裂

在萼片未張開的花蕾中，很多花粉母細胞處于減數分裂時期。進入減數分裂的花粉母細胞體積增大，原生質體濃厚，容易與周圍的其他細胞區分開來。前期Ⅰ持續時間較長，染色體形態變化較大。偶線期同源染色體開始聯會，染色體呈花束狀（圖1-1）；粗線期聯會已經完成，且染色體繼續縮短變粗；雙線期染色體進一步螺旋化并加粗，聯會復合體已經解體，但各非姊妹染色體仍由交叉結連結在一起，表現為“X”等構型（圖1-2）；終變期染色體進一步螺旋，達到最粗，并開始向細胞中央集中，逐步進入中期Ⅰ（圖1-3）；完全進入中期Ⅰ的細胞中，二價體排列在赤道板附近，極面觀12個二價體清晰可計數（圖1-4），垂面觀可見棒狀、“E”形二價體，且二價體中的2條染色體有分開的趨勢（圖1-5）；由于紡錘絲的牽引，同源染色體分離，并且向兩極移動，進入后期Ⅰ（圖1-6）；染色體移至兩極，核膜重新出現，此后直到染色體松散，進入前期Ⅱ，細胞質一直未見分裂（圖1-7）；隨著核膜消失，染色體凝縮至清晰可辨，進入減數分裂中期Ⅱ，垂面觀可見二價紡錘面呈現一定角度（圖1-8）；染色單體分離，核

膜形成，細胞壁尚未形成，進入末期Ⅱ，多數細胞中只見到3個細胞核（圖1-9）；隨后產生胼胝質壁，把4個細胞隔開，形成四分體，四分體也多為四面體型（圖1-10），極少數為平面型（圖1-11）。

2.2雄配子體發育

花萼已張開的花蕾中，多數花粉母細胞已完成減數分裂，處于四分體及隨后時期。四分體胼胝質壁解體，釋放出小孢子，進入雄配子體發育過程。同大多數作物類似，剛釋放出來處于單核早期的小孢子形狀不規則，細胞質中沒有液泡，小孢子體積小；隨后細胞核位于細胞中央，細胞不同部位開始出現小液泡，為單核居中期（圖1-12）；受液泡的擠壓，細胞核向細胞壁靠近，核膜清晰，為單核靠邊期（圖1-13）；隨后核膜消失，出現清晰可辨的12條染色體，進入單核有絲分裂中期（圖1-14）；有絲分裂完成后，小孢子進入二核期，剛分裂產生的2個細胞核，除1個細胞核熒光較亮外，形狀、大小差異不大（圖1-15）；隨后較亮的細胞形狀由圓變扁、由短變長，小孢子體積也不斷增大，但細胞不再分裂（圖1-16至圖1-18）。成熟花粉粒多為橢球形，但不同花粉粒之間有一定差異（圖1-19）。endprint

2.3雄配子體發育時期及與花蕾形態特征之間的關系

由于單核中期細胞大小與四分體類似，而四分體之前的花粉母細胞體積小于四分體，且從結構上易與小孢子區分開來，因此可以根據細胞體積判斷雄配子體發育階段：小于四分體則為單核早期，等于或接近四分體則為單核中晚期，明顯大于四分體則為二核期。據此對（2）至（4）級花蕾中細胞發育階段進行統計，發現（2）級花蕾中約有4%細胞為四分體，其余多數為單核小孢子；（3）級花蕾中均為單核小孢子，且僅3%處于單核早期，其余為單核中晚期；（4）級花蕾中80%以上的細胞處于雙核期。

3結論與討論

本研究首次用熒光染色觀察法探討了茄子花粉母細胞減數分裂及其雄配子體發育各個時期的主要特征，以及單核期小孢子所對應的花蕾形態特征。采用了24 h低溫預處理、熒光染色方法，染色體在各個時期特征非常明顯，染色體發出明亮的熒光，避免了細胞質中其他物質的干擾，對于茄子、白菜等花粉壁熒光不強烈的材料，即使觀察雄配子體發育也不需要進行冬青油透明。適合茄屬植物游離小孢子培養的花粉發育時期一般為單核期或單核中晚期[11-14]。小孢子發育時期與花蕾形態特征密切相關，多數研究者用花蕾直徑、花蕾長、花藥顏色[15]，花蕾瓣長與萼裂比[16]，花瓣長與萼裂基部之差等作為適宜培養的小孢子發育時期相關形態特征，并以此作為取樣依據[17]。本研究表明，花瓣長度與花萼筒長度之間的差值可以作為茄子小孢子培養的取材依據，這與馬欣的結論[17]類似。

參考文獻：

[1]Collonnier C，Fock I，Kashyap V，et al. Applications of biotechnology in eggplant[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2001，65（2）：91-107.

[2]錢春桃，陳勁楓，婁群峰，等. 黃瓜花粉母細胞減數分裂行為的研究[J]. 武漢植物學研究，2003，21（3）：193-197.

[3]Ali M，Fujieda K. Cross compatibility between eggplant（Solanum melongena L.）and wild relatives[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1990，58（4）：977-984.

[4]詹園鳳，黨選民，曹振木，等. 3種野生茄和1個栽培茄的核型分析[J]. 熱帶作物學報，2009，30（4）：456-460.

[6]萬雙粉，張蜀寧，張杰. 青花菜花粉母細胞減數分裂及雄配子體發育[J]. 西北植物學報，2006，26（5）：970-975.

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[8]崔群香，王倩，唐紅艷，等. 同源四倍體普通白菜花粉母細胞減數分裂及其雄配子體發育研究[J]. 揚州大學學報：農業與生命科學版，2012，33（4）：56-60.

[9]楊弘遠. 用熒光染色與冬青油透明技術顯示花粉細胞核[J]. 植物學報，1988，30（3）：242-247，342.

[10]崔群香，劉衛東，吳敏，等. 用熒光染色法觀察南瓜雄配子體發育過程[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：135-137.

[11]劉獨臣，房超，李躍建，等. 茄子花藥培養誘導胚狀體成苗[J]. 西南農業學報，2008，21（6）：1643-1646.

[12]連勇，劉富中，陳鈺輝，等. 茄子體細胞雜種游離小孢子培養獲得再生植株[J]. 園藝學報，2004，31（2）：233-235.

[13]佟曦然，顧淑榮，朱至清，等. 茄子游離小孢子培養中小孢子發育的細胞學觀察[J]. 農業生物技術學報，2007，15（5）：861-866.

[14]朱朝輝，鐘開勤，黃建都，等. 茄子游離小孢子培養初探[J]. 熱帶作物學報，2011，32（10）：1883-1887.

[15]李亞榮. 茄子（Solanum melongena L.）花藥離體培養的研究[D]. 重慶：西南大學，2008.

[16]宋彥平，申書興，王彥華，等. 茄子游離小孢子培養獲得愈傷組織的研究[J]. 河北農業大學學報，2007，30（3）：32-35.

[17]馬欣. 茄子游離小孢子培養及其形態發育學觀察[D]. 保定：河北農業大學，2006.endprint

2.3雄配子體發育時期及與花蕾形態特征之間的關系

由于單核中期細胞大小與四分體類似，而四分體之前的花粉母細胞體積小于四分體，且從結構上易與小孢子區分開來，因此可以根據細胞體積判斷雄配子體發育階段：小于四分體則為單核早期，等于或接近四分體則為單核中晚期，明顯大于四分體則為二核期。據此對（2）至（4）級花蕾中細胞發育階段進行統計，發現（2）級花蕾中約有4%細胞為四分體，其余多數為單核小孢子；（3）級花蕾中均為單核小孢子，且僅3%處于單核早期，其余為單核中晚期；（4）級花蕾中80%以上的細胞處于雙核期。

3結論與討論

本研究首次用熒光染色觀察法探討了茄子花粉母細胞減數分裂及其雄配子體發育各個時期的主要特征，以及單核期小孢子所對應的花蕾形態特征。采用了24 h低溫預處理、熒光染色方法，染色體在各個時期特征非常明顯，染色體發出明亮的熒光，避免了細胞質中其他物質的干擾，對于茄子、白菜等花粉壁熒光不強烈的材料，即使觀察雄配子體發育也不需要進行冬青油透明。適合茄屬植物游離小孢子培養的花粉發育時期一般為單核期或單核中晚期[11-14]。小孢子發育時期與花蕾形態特征密切相關，多數研究者用花蕾直徑、花蕾長、花藥顏色[15]，花蕾瓣長與萼裂比[16]，花瓣長與萼裂基部之差等作為適宜培養的小孢子發育時期相關形態特征，并以此作為取樣依據[17]。本研究表明，花瓣長度與花萼筒長度之間的差值可以作為茄子小孢子培養的取材依據，這與馬欣的結論[17]類似。

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[15]李亞榮. 茄子（Solanum melongena L.）花藥離體培養的研究[D]. 重慶：西南大學，2008.

[16]宋彥平，申書興，王彥華，等. 茄子游離小孢子培養獲得愈傷組織的研究[J]. 河北農業大學學報，2007，30（3）：32-35.

[17]馬欣. 茄子游離小孢子培養及其形態發育學觀察[D]. 保定：河北農業大學，2006.endprint

2.3雄配子體發育時期及與花蕾形態特征之間的關系

由于單核中期細胞大小與四分體類似，而四分體之前的花粉母細胞體積小于四分體，且從結構上易與小孢子區分開來，因此可以根據細胞體積判斷雄配子體發育階段：小于四分體則為單核早期，等于或接近四分體則為單核中晚期，明顯大于四分體則為二核期。據此對（2）至（4）級花蕾中細胞發育階段進行統計，發現（2）級花蕾中約有4%細胞為四分體，其余多數為單核小孢子；（3）級花蕾中均為單核小孢子，且僅3%處于單核早期，其余為單核中晚期；（4）級花蕾中80%以上的細胞處于雙核期。

3結論與討論

本研究首次用熒光染色觀察法探討了茄子花粉母細胞減數分裂及其雄配子體發育各個時期的主要特征，以及單核期小孢子所對應的花蕾形態特征。采用了24 h低溫預處理、熒光染色方法，染色體在各個時期特征非常明顯，染色體發出明亮的熒光，避免了細胞質中其他物質的干擾，對于茄子、白菜等花粉壁熒光不強烈的材料，即使觀察雄配子體發育也不需要進行冬青油透明。適合茄屬植物游離小孢子培養的花粉發育時期一般為單核期或單核中晚期[11-14]。小孢子發育時期與花蕾形態特征密切相關，多數研究者用花蕾直徑、花蕾長、花藥顏色[15]，花蕾瓣長與萼裂比[16]，花瓣長與萼裂基部之差等作為適宜培養的小孢子發育時期相關形態特征，并以此作為取樣依據[17]。本研究表明，花瓣長度與花萼筒長度之間的差值可以作為茄子小孢子培養的取材依據，這與馬欣的結論[17]類似。

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[9]楊弘遠. 用熒光染色與冬青油透明技術顯示花粉細胞核[J]. 植物學報，1988，30（3）：242-247，342.

[10]崔群香，劉衛東，吳敏，等. 用熒光染色法觀察南瓜雄配子體發育過程[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：135-137.

[11]劉獨臣，房超，李躍建，等. 茄子花藥培養誘導胚狀體成苗[J]. 西南農業學報，2008，21（6）：1643-1646.

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[14]朱朝輝，鐘開勤，黃建都，等. 茄子游離小孢子培養初探[J]. 熱帶作物學報，2011，32（10）：1883-1887.

[15]李亞榮. 茄子（Solanum melongena L.）花藥離體培養的研究[D]. 重慶：西南大學，2008.

[16]宋彥平，申書興，王彥華，等. 茄子游離小孢子培養獲得愈傷組織的研究[J]. 河北農業大學學報，2007，30（3）：32-35.

[17]馬欣. 茄子游離小孢子培養及其形態發育學觀察[D]. 保定：河北農業大學，2006.endprint