觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)研究進展

謝園園+楊金雨露+吳玲+曹麗平+賴齊賢

摘要：介紹了觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)研究進展，并對游離小孢子培養(yǎng)技術進行了分析，探討了影響單倍體植株獲得的因素，闡述了存在的問題，并對游離小孢子育種技術進行了展望。

關鍵詞：觀賞植物；游離小孢子培養(yǎng)；單倍體；育種

中圖分類號：S680.4文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）02-0134-04

收稿日期：2013-07-05

作者簡介：謝園園（1990—），女，安徽六安人，碩士研究生，主要從事園林植物遺傳育種研究。E-mail： xieyuanyuanyx@163.com。

通信作者：賴齊賢，博士，教授，從事花卉育種、園藝植物栽培研究。E-mail：laiqixian@zafu.edu.cn。我國觀賞植物種類繁多，它們有著各自不同的形態(tài)、生態(tài)習性、繁殖方式，很多觀賞植物還兼具藥用、食用價值。近年來，世界各國花卉產業(yè)發(fā)展速度較快，進行花卉育種以獲得優(yōu)質花卉品種顯得尤為重要。各國開始重視保護、收集珍稀瀕危或者性狀優(yōu)良的植物品種，很多學者曾考慮利用單倍體育種來快速保存種質資源，但單倍體植物生長勢弱、無法結種、利用價值不高。因此，部分學者開始在實驗室條件下探討生產單倍體植株的方法，以期在短期內獲得純合體，縮短育種進程。1953年，Tulecke首次通過培養(yǎng)銀杏花粉成功得到愈傷組織，但最終并未長成完整植株[1]。1964年，研究人員利用曼陀羅（Datura stramonium L.）花藥培育出完整的單倍體植株，自此單倍體育種逐漸成為研究熱點。游離小孢子培養(yǎng)是單倍體育種方法之一，它是在花藥培養(yǎng)的基礎上發(fā)展起來的，不經(jīng)過任何形式的花藥預培養(yǎng)，直接從花蕾或花藥中獲得游離的、新鮮的小孢子群體進行培養(yǎng)[2]。1982年，Lichter首次通過培養(yǎng)甘藍型油菜（Brassica napus）花粉成功獲得單倍體植株[3]，從此開創(chuàng)了游離小孢子培養(yǎng)技術。目前，游離小孢子培養(yǎng)技術已逐漸變成重要的育種方法，但關于花卉方面的研究較少。本研究對近年來觀賞植物小孢子培養(yǎng)進展進行綜述。

1觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)現(xiàn)狀

目前游離小孢子培養(yǎng)成功的觀賞植物主要集中在草本植物，涉及的科屬較為廣泛。其中培養(yǎng)成功的十字花科植物有2例，十字花科蔬菜類植物是迄今為止胚誘導成功并長成植株最多的科屬，這可能是由于十字花科植物基因對胚誘導響應能力較強，同時也與人們對蔬菜作物育種較為重視有關（表1）。菊科植物基因在小孢子培養(yǎng)方面可能具有頑拗性，導致其胚發(fā)生較為困難。

2小孢子培養(yǎng)技術

2.1預處理方法

小孢子培養(yǎng)所用的花序經(jīng)常采用10 ℃以下的低溫進行預處理，預處理時間不等，通常為24～48 h。有學者認為，低溫可以誘導玉米、小麥、水稻等植物小孢子胚狀體發(fā)育[19-20]。低溫也可以提高煙草胚性花粉數(shù)，進而發(fā)育成胚胎[21-22]。朱彥濤等對長0～40 cm的甘藍型油菜花序低溫處理 0～10 d，發(fā)現(xiàn)處理時間隨著花序長度的增加而延長，適當?shù)牡蜏靥幚砜梢匝泳徯℃咦拥耐嘶俣龋瑥亩娱L材料的保存時間，但保存時間過長，胚產量下降[23]。在一些植物的游離小孢子培養(yǎng)中，不進行花蕾預處理同樣可以獲得胚狀體，因此，有學者認為，對于某些植物的花蕾進行低溫預處理是不必要的[24]。對于某些植物來說，對花粉進行適當?shù)念A處理是不可缺少的。

2.2分離純化技術

分離是將小孢子從花藥中分離出來，純化即篩選胚性小孢子，淘汰非胚性小孢子，分離純化有利于提高胚發(fā)生率，分離技術主要包括以下3種。

2.2.1擠壓法將花藥置于盛有少量液體培養(yǎng)基的容器中，用玻璃棒或其他工具進行擠壓，將花粉釋放出來，此種方法比較適合雙子葉植物，缺點是獲得的花粉中可能混有體細胞，同時花粉密度不易控制[27-28]。

2.2.2自然散落法把花藥接在液體培養(yǎng)基上一段時間，使小孢子從自然開裂的藥室中散落出來，此方法不會對花粉粒造成損傷，但無法充分分離花粉[25，28-30]。

2.2.3機械游離法

2.2.3.1磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液及滲透壓穩(wěn)定劑中的花藥，使花粉游離出來，這種方法會對花粉造成不同程度的機械損傷[27]。

2.2.3.2超速旋切法微型攪拌器中的高速旋轉切刀可以破碎花蕾等，使小孢子游離出來。1989年Swanson等首先運用這種方法分離了油菜小孢子，之后這種方法在禾本科植物花粉分離及培養(yǎng)上得到廣泛應用[31]。譚德冠等采用直接研磨法與間接研磨法對巴西橡膠樹游離小孢子進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)間接研磨法較為適宜[25]。間接研磨法應去除花瓣、花萼，僅對雄蕊進行研磨分離，直接研磨法是對整朵雄花進行研磨，相比較而言，間接法雖然工作量大，但可以有效減少污染，同時分離出雜質較少的小孢子。植物游離小孢子培養(yǎng)過程中，對小孢子進行純化是不可缺少的環(huán)節(jié)，純化可以減少植物體細胞以及非胚性小孢子對小孢子培養(yǎng)的影響。小孢子純化方法主要包括蔗糖濃度梯度法[32]、percoll密度梯度法[33]、麥芽糖濃度梯度離心法等方法，其中percoll方法效果最好。采用不連續(xù)percoll密度梯度離心法篩選胚性小孢子，可以將大量無胚性小孢子淘汰掉，提高產胚率。這種不連續(xù)percoll密度梯度離心方法要優(yōu)于普通的蔗糖、聚蔗糖密度梯度離心法，但這種方法成本相對較高，因此應用并不廣泛[34-36]。

2.3花粉培養(yǎng)方法

2.3.1直接培養(yǎng)法直接培養(yǎng)法即對花藥不作任何預處理，直接分離出花粉并接種于培養(yǎng)基上。1981年，研究人員通過這種培養(yǎng)方式得到芍藥愈傷組織繼而獲得單倍體植株。同年，陳英等也通過此方法誘導得到水稻植株[37]。

2.3.2花藥預培養(yǎng)后分離花粉法花藥預培養(yǎng)后分離花粉法即對花藥進行一定的預處理（如低溫處理等），然后分離出花粉，將其置于液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此方法應用較為普遍。endprint

2.3.3添加花藥提取物的花粉培養(yǎng)法先將花藥接種在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周左右，然后取出花藥，將花藥浸入沸水中，再進行研磨離心，保留上清液，將上清液過濾滅菌加入培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)花粉粒。很多學者在研究大麥花粉發(fā)育時采用此方法培養(yǎng)花粉粒[38-39]。

2.3.4哺育培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)已經(jīng)裂開的胚狀體或愈傷組織誘導率高的花藥作為哺育組織，此種花藥可以是不同種植物，將需要培養(yǎng)的花粉接種到花藥里進行哺育培養(yǎng)。Sharp等曾經(jīng)利用這種方法誘導番茄花粉形成單倍體細胞無性系，但最終未能誘導成植株[40]。

2.3.5微室培養(yǎng)用蓋玻片或載玻片制作成微室，將花粉粒接種在裝有培養(yǎng)基的微室中進行培養(yǎng)。1977年，谷明光等曾用此法成功將煙草花粉誘導成胚狀體[41]。

3小孢子研究影響因素

3.1材料基因型

植物的基因型對游離小孢子培養(yǎng)過程中胚狀體及愈傷組織的發(fā)生尤為關鍵。Takahata等研究了11種不同基因型蘿卜的胚誘導能力，發(fā)現(xiàn)有5種不同基因型的蘿卜對誘導不響應，不能產生胚狀體。2007年，馮輝等研究了18種不同基因型羽衣甘藍F1代雜交種獲得胚狀體的比例，結果顯示，皺葉紅心胚狀體產率最高，紅珊瑚、白珊瑚、紅珊瑚3個品種都無胚狀體產生[42]。這可能是由于在植物的基因組中存在調控植物小孢子啟動的基因，不同植物的啟動基因表達所需的條件不同。

3.2植株生長狀況

植株生長狀況直接關系到花粉的發(fā)育狀態(tài)，從而影響植物游離小孢子試驗成功與否。植物生長健壯是獲得胚狀體及愈傷組織的首要條件。研究發(fā)現(xiàn)，當油菜供體植株生長狀況良好時可直接誘導小孢子發(fā)育同步化，提高單核期小孢子的核質指數(shù)及產胚量[43]。研究表明，在溫室中生長的植株小孢子誘導率低于生長在大田中的植株[44]。

3.3小孢子發(fā)育階段

小孢子發(fā)育階段主要包括單核早期、單核中期、單核晚期（即單核靠邊期）、雙核期等。研究認為，單核中期之前的花粉過于幼嫩，雙核早期之后的花粉太過成熟。對于大多數(shù)植物來說，單核中晚期到雙核早期是最適合的小孢子發(fā)育階段，單核晚期成胚率最大。對于不同基因型的植物來說，其最適階段稍有差異，可以通過使用染色劑如醋酸洋紅、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）來確定發(fā)育時期。應根據(jù)不同植物品種選擇對應時期的花蕾。選擇合適的洛神葵植物時，Ma′arup 等選取直徑為0.8～1.0 cm的花蕾，發(fā)現(xiàn)此時的花蕾包括98%單核期小孢子及2%雙核期小孢子[11]。

3.4培養(yǎng)基類型及其他附加成分

目前還沒有1種可以普遍應用于植物游離小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基。Maarup等在誘導山茶小孢子胚過程中，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基誘導率要高于N6培養(yǎng)基，液體MS培養(yǎng)基也適合洛神葵游離小孢子培養(yǎng)[11]。在馬蹄蓮游離小孢子培養(yǎng)中，Wang等使用了NLN、N6、B5、Nitsch等4種培養(yǎng)基，結果表明，NLN培養(yǎng)基中小孢子成胚率最高[10]。對于某些植物來說，加入激素可以提高胚狀體產出率，激素成分以及濃度隨植物品種的變化而變化。常用的激素有NAA、6-BA、2，4-D、TDZ、KT等。研究人員搭配使用2，4-D與NAA 2種激素進行芍藥的小孢子培養(yǎng)，結果表明，2 mg/L NAA條件下，小孢子分化率最高[4]。并不是所有植物進行胚誘導時都需要加入激素。碳源的種類及濃度與胚狀體發(fā)生也密切相關。Kim等比較了不同濃度蔗糖、麥芽糖對辣椒（Capsicum annuum L.）胚胎誘導的影響，發(fā)現(xiàn)9%蔗糖是誘導辣椒胚胎發(fā)育的最佳碳源[45]。活性炭是一種良好的吸附劑，被廣泛應用于植物組織培養(yǎng)[46-47]。

3.5小孢子培養(yǎng)密度

小孢子的培養(yǎng)密度對胚狀體及愈傷組織的獲得也有很大影響。付文婷等在大白菜游離小孢子胚誘導過程中將小孢子培養(yǎng)密度調整為1×104個/mL[48]。在蘆筍游離小孢子培養(yǎng)過程中，湯泳萍等將小孢子密度調整為1.5×105個/mL[49]。當小孢子密度低于5×104個/mL時，最適合大麥集群化生長[50]。細胞密度對細胞生長與分裂影響極大。細胞能夠合成某些分裂時所必需的化合物，只有當這些化合物的內生濃度達到臨界值后，細胞才能進行分裂。可見，懸浮培養(yǎng)時小孢子密度會直接影響胚發(fā)生率，密度過高時，營養(yǎng)物質會被耗盡，同時細胞會釋放某些有毒物質，影響其他小孢子胚的發(fā)生，但細胞生長具有群體效應，密度過低又會導致小孢子無法正常生長，極大地降低成胚率。

4存在的問題

目前游離小孢子培養(yǎng)在洋甘菊、一枝黃花、蛇目菊、纈草等很多菊科植物中都以失敗而告終[51]。游離小孢子培養(yǎng)成功與否受到基因型、生長環(huán)境、培養(yǎng)基成分等的影響。同時，花蕾預處理、分離純化、花粉培養(yǎng)方法也影響胚誘導能否成功。游離小孢子培養(yǎng)雖然避免了體細胞的影響，但花粉也失去了花藥壁的保護，有時有極少的二倍體、多倍體植株發(fā)育。觀賞植物的游離小孢子培養(yǎng)技術目前尚不成熟，盡管前人已經(jīng)從小孢子胚胎發(fā)生的細胞形態(tài)學、代謝水平、分子水平等方面探究了小孢子胚胎發(fā)生機制，但觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)獲得單倍體植株的誘導機制、啟動機理、發(fā)育途徑等尚不明確，嚴重阻礙了觀賞植物游離小孢子育種進程。

5展望

原始的雜交育種方式存在育種周期長、效率低、管理繁瑣等問題，單倍體育種具有育種年限短、選擇效率高等優(yōu)勢。同時，基因工程采用游離小孢子培養(yǎng)技術，可以為植物育種及基因定位生產雙單倍體（即重組自交系），以克服遠緣雜交不親和性。在誘導胚狀體過程中花粉容易產生變異，因此，游離小孢子育種還可作為引發(fā)突變的手段。研究游離小孢子培養(yǎng)技術、探討影響觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)的因素、提高小孢子誘導率，是探究游離小孢子培養(yǎng)技術中亟需解決的難題。

參考文獻：

[1]Tulecke W R. A tissue derived from the pollen of Ginkgo biloba[J]. Science，1953，117（3048）：599-600.endprint

[2]郭金英，申書興，陳雪平，等. 十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進展[J]. 河北農業(yè)大學學報，2002，25（增刊）：122-124.

[3]Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie，1982，105（5）：427-434.

[4]Ono K，Harashima S. Induction of haploid callus from isolated microspores of peony in vitro[J]. Plant and Cell Physiology，1981，22（2）：337-341.

[5]張舉仁，鄭國锠.天仙子（Hyoscyamus niger L.）花粉植株形態(tài)發(fā)生的途徑[J]. 實驗生物學報，1984，17（3）：107-113.

[6]Pedroso M C，Pais M S. Induction of microspore embryogenesis in Camellia japonica cv. Elegans[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1994，37（2）：129-136.

[7]Zhao X G，Wang W G，Li Y D，et al. In vitro maturation and germination of Orychophragmus violaceus microspores[J]. Plant Cell Tissue Organ Culture，2007，91：53-60.

[8]Zhang W，F(xiàn)u Q，Dai X G，et al. The culture of isolated microspores of ornamental kale （Brassica oleracea var. acephala） and the importance of genotype to embryo regeneration[J]. Scientia Horticulturae，2008，117（1）：69-72.

[9]姜鳳英，馮輝，王超楠. 羽衣甘藍的小孢子胚誘導和植株再生[J]. 植物生理學通訊，2005，41（6）：725-727.

[10]Wang S，Li X，Yang L，et al. Microspore culture of Zantedeschia aethiopica：The role of monosaccharides in sporophytic development[J]. African Journal of Biotechnology，2011，10（50）：10287-10292.

[11]Maarup R，Aziz M A，Osman M. Development of a procedure for production of haploid plants through microspore culture of roselle（Hibiscus sabdariffa L.）[J]. Scientia Horticulturae，2012，145（20）：52-61.

[12]Oroojloo M，Shariatpanahi M E，Dehestani M，et al. Influence of isolation and culture media on induction of microspore embryogenesis in roses（Rosa hybrida）[J]. Seed and Plant Improvement Journal，2012，28（2）：327-333.

[13]Sangwan R S，Norreel B. Induction of plants from pollen grains of Petunia cultured in vitro[J]. Nature，1975，257：222-224.

[14]Tulecke W. The pollen of Ginkgo biloba：in vitro culture and tissue formation[J]. Botanical Society of America，1957，44（7）：602-608.

[15]Ormerod A J，Caligari P S. Anther and microspore culture of Lupinus albus in liquid culture medium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1994，36（2）：227-236.

[16]Bal U，Touraev A. Microspore embryogenesis in selected medicinal and ornamental species of the Asteraceae[M]. New York：Springer Science，2009：219-229.

[17]Coumans M，Zhong D N. Doubled haploid sunfower（Helianthus annuus） plant production by androgenesis：fact or artifact？ Part 2. In vitro isolated microspore culture[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1995，41（3）：203-209.endprint

[18]Yang J S，Endo M，Inada I. Microspore culture of chrysanthemum [Dendranthema grandiflorum （Ramat.） Kitam.][J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，2005，74（1）：78-86.

[19]Touraev A，Pfosser M，Heberle-Bors E. The microspore：a haploid multipurpose cell[J]. Advances in Botanical Research，2001，35：53-109.

[20]Touraev A，Vicente O，Heberle-Bors E. Initiation of microspore embryogenesis by stress[J]. Trends Plant Science，1997，2（8）：297-302.

[21]Heberle-Bors E. In vitro pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L.and its relation to pollen sterility，sex balance and floral induction of pollen donor plants[J]. Planta，1982，156（5）：396-401.

[22]Heberle-Bors E. On the time of embryogenic pollen grain induction during sexual development of Nicotiana tabacum L. plants[J]. Planta，1982，156（5）：402-406.

[23]朱彥濤，李殿榮，楊淑慎.低溫預處理和基因型對甘藍型油菜小孢子胚胎發(fā)生的影響[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2005，33（5）：88-94.

[24]Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie，1982，105（5）：427-434.

[25]譚德冠，吳煜，孫雪飄，等. 巴西橡膠樹游離小孢子培養(yǎng)[J]. 熱帶作物學報，2011，32（5）：840-844.

[26]高素燕，李英，單曉政，等. 預處理對不結球白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響[J]. 江蘇農業(yè)學報，2008，24（6）：878-881.

[27]陳曉亞，湯章城. 植物生理與分子生物學[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2007：113-114.

[28]楊淑琴，婁虹，韓陽. 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進展[J]. 遼寧大學學報：自然科學版，2005，32（1）：91-96.

[29]Ferrie A M R，Caswell K L. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2010，104（3）：301-309.

[30]佟曦然，顧淑榮，朱至清，等. 茄子游離小孢子培養(yǎng)中小孢子發(fā)育的細胞學觀察[J]. 農業(yè)生物技術學報，2007，15（5）：861-866.

[31]Swanson E B，Herrgesell M J，Arnoldo M，et al. Microspore mutagenesis and selection：Canola plants with field tolerance to the imidazolinones[J]. Theoretical and Applied Genetics，1989，78（4）：525-530.

[32]Harris R，Wright M，Byrne M，et al. Callus formation and plantlet regeneration from protoplasts derived from suspension cultures of wheat（Triticum aestivum L.）[J]. Plant Cell Reports，1988，7（5）：337-340.

[33]黃大年，谷明光，顏秋生，等. 應用percoll密度梯度離心分離不同類型的花粉粒[J]. 遺傳，1983，5（2）：10-12.

[34]Joersbo M，Jorgensen R B，Olesen P. Transient electropermeabilization of barley（Hordeum vulgare L.） microspores to propidium iodide[J]. Plant Cell Tissue Organ Culture，1990，23（2）：125-129.

[35]Takahata Y，Komatsu H，Kaizuma N. Microspore culture of radish（Raphanus sativus L.）：influence of genotype and culture conditions on embryogenesis[J]. Plant Cell Reports，1996，16（3/4）：163-166.endprint

[36]付傳翠，張麗，王富，等. 蘿卜游離小孢子培養(yǎng)中胚性小孢子的選擇[J]. 西北農業(yè)學報，2007，16（4）：174-176.

[37]陳英，左秋仙，李淑媛，等. 水稻游離花粉培養(yǎng)誘導形成綠色植株及有關作用因素的研究[J]. 遺傳學報，1981，8（2）：158-163.

[38]許智宏，黃斌. 大麥花粉愈傷組織形成中的花藥因子[J]. 植物學報，1984，26（1）：1-10.

[39]Xu Z H，Huang B，Sunderland N. Culture of barley anthers in conditioned media[J]. Journal of Experimental Botany，1981，32（4）：767-778.

[40]Sharp W R，Raskin R S. The use of nurse culture in the development of haploid clones in tomato[J]. Planta，1972，104：357-361.

[41]谷明光，鄭萬珍，黃大年，等. 小麥、水稻、煙草花粉粒離體培養(yǎng)[J]. 遺傳學報，1977，4（4）：333-340.

[42]馮輝，馮建云，姜鳳英，等. 影響羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)中胚狀體發(fā)生的幾個因素[J]. 植物生理學通訊，2007，43（3）：545-546.

[43]管春云. 油菜小孢子培養(yǎng)和雙單倍體育種研究：1.供體植株和小孢子密度對小孢子培養(yǎng)的影響[J]. 作物學報，1995，21（6）：665-670.

[44]Ercan N，Sensoy F A，Sensoy A S. Influence of growing season and donor plant age on anther culture response of some pepper cultivars（Capsicum annuum L.）[J]. Scientia Horticulturae，2006，110（1）：16-20.

[45]Kim M，Jang I C，Kim J A，et al. Embryogenesis and plant regeneration of hot pepper（Capsicum annuum L.）through isolated microspore culture[J]. Plant Cell Reports，2008，27（3）：425-434.

[46]田保明，蔣武生，張曉偉，等. 提高油菜游離小孢子胚誘導頻率的研究[J]. 華北農學報，2007，22（1）：116-119.

[47]蔣武生，張曉偉，姚秋菊，等. 活性炭對小白菜游離小孢子培養(yǎng)的影響[J]. 華北農學報，2008，23（5）：93-96.

[48]付文婷，張魯剛，胥宇建，等. 大白菜游離小孢子胚誘導及植株再生[J]. 西北農業(yè)學報，2010，19（3）：139-143.

[49]湯泳萍，周勁松，羅紹春，等. 蘆筍游離小孢子培養(yǎng)研究初報[J]. 江西農業(yè)學報，2011，23（3）：14-16，19.

[50]Davies P A，Morton S. A comparison of barley isolated microspore and anther culture and the influence of cell culture density[J]. Plant Cell Reports，1998，17（3）：206-210.

[51]Bal U，Touraev A. Microspore embryogenesis in selected medicinal and ornamental species of the asteraceae[M]. New York：Springer Science，2009：219-229.endprint

[36]付傳翠，張麗，王富，等. 蘿卜游離小孢子培養(yǎng)中胚性小孢子的選擇[J]. 西北農業(yè)學報，2007，16（4）：174-176.

[37]陳英，左秋仙，李淑媛，等. 水稻游離花粉培養(yǎng)誘導形成綠色植株及有關作用因素的研究[J]. 遺傳學報，1981，8（2）：158-163.

[38]許智宏，黃斌. 大麥花粉愈傷組織形成中的花藥因子[J]. 植物學報，1984，26（1）：1-10.

[39]Xu Z H，Huang B，Sunderland N. Culture of barley anthers in conditioned media[J]. Journal of Experimental Botany，1981，32（4）：767-778.

[40]Sharp W R，Raskin R S. The use of nurse culture in the development of haploid clones in tomato[J]. Planta，1972，104：357-361.

[41]谷明光，鄭萬珍，黃大年，等. 小麥、水稻、煙草花粉粒離體培養(yǎng)[J]. 遺傳學報，1977，4（4）：333-340.

[42]馮輝，馮建云，姜鳳英，等. 影響羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)中胚狀體發(fā)生的幾個因素[J]. 植物生理學通訊，2007，43（3）：545-546.

[43]管春云. 油菜小孢子培養(yǎng)和雙單倍體育種研究：1.供體植株和小孢子密度對小孢子培養(yǎng)的影響[J]. 作物學報，1995，21（6）：665-670.

[44]Ercan N，Sensoy F A，Sensoy A S. Influence of growing season and donor plant age on anther culture response of some pepper cultivars（Capsicum annuum L.）[J]. Scientia Horticulturae，2006，110（1）：16-20.

[45]Kim M，Jang I C，Kim J A，et al. Embryogenesis and plant regeneration of hot pepper（Capsicum annuum L.）through isolated microspore culture[J]. Plant Cell Reports，2008，27（3）：425-434.

[46]田保明，蔣武生，張曉偉，等. 提高油菜游離小孢子胚誘導頻率的研究[J]. 華北農學報，2007，22（1）：116-119.

[47]蔣武生，張曉偉，姚秋菊，等. 活性炭對小白菜游離小孢子培養(yǎng)的影響[J]. 華北農學報，2008，23（5）：93-96.

[48]付文婷，張魯剛，胥宇建，等. 大白菜游離小孢子胚誘導及植株再生[J]. 西北農業(yè)學報，2010，19（3）：139-143.

[49]湯泳萍，周勁松，羅紹春，等. 蘆筍游離小孢子培養(yǎng)研究初報[J]. 江西農業(yè)學報，2011，23（3）：14-16，19.

[50]Davies P A，Morton S. A comparison of barley isolated microspore and anther culture and the influence of cell culture density[J]. Plant Cell Reports，1998，17（3）：206-210.

[51]Bal U，Touraev A. Microspore embryogenesis in selected medicinal and ornamental species of the asteraceae[M]. New York：Springer Science，2009：219-229.endprint

[36]付傳翠，張麗，王富，等. 蘿卜游離小孢子培養(yǎng)中胚性小孢子的選擇[J]. 西北農業(yè)學報，2007，16（4）：174-176.

[37]陳英，左秋仙，李淑媛，等. 水稻游離花粉培養(yǎng)誘導形成綠色植株及有關作用因素的研究[J]. 遺傳學報，1981，8（2）：158-163.

[38]許智宏，黃斌. 大麥花粉愈傷組織形成中的花藥因子[J]. 植物學報，1984，26（1）：1-10.

[39]Xu Z H，Huang B，Sunderland N. Culture of barley anthers in conditioned media[J]. Journal of Experimental Botany，1981，32（4）：767-778.

[40]Sharp W R，Raskin R S. The use of nurse culture in the development of haploid clones in tomato[J]. Planta，1972，104：357-361.

[41]谷明光，鄭萬珍，黃大年，等. 小麥、水稻、煙草花粉粒離體培養(yǎng)[J]. 遺傳學報，1977，4（4）：333-340.

[42]馮輝，馮建云，姜鳳英，等. 影響羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)中胚狀體發(fā)生的幾個因素[J]. 植物生理學通訊，2007，43（3）：545-546.

[43]管春云. 油菜小孢子培養(yǎng)和雙單倍體育種研究：1.供體植株和小孢子密度對小孢子培養(yǎng)的影響[J]. 作物學報，1995，21（6）：665-670.

[44]Ercan N，Sensoy F A，Sensoy A S. Influence of growing season and donor plant age on anther culture response of some pepper cultivars（Capsicum annuum L.）[J]. Scientia Horticulturae，2006，110（1）：16-20.

[45]Kim M，Jang I C，Kim J A，et al. Embryogenesis and plant regeneration of hot pepper（Capsicum annuum L.）through isolated microspore culture[J]. Plant Cell Reports，2008，27（3）：425-434.

[46]田保明，蔣武生，張曉偉，等. 提高油菜游離小孢子胚誘導頻率的研究[J]. 華北農學報，2007，22（1）：116-119.

[47]蔣武生，張曉偉，姚秋菊，等. 活性炭對小白菜游離小孢子培養(yǎng)的影響[J]. 華北農學報，2008，23（5）：93-96.

[48]付文婷，張魯剛，胥宇建，等. 大白菜游離小孢子胚誘導及植株再生[J]. 西北農業(yè)學報，2010，19（3）：139-143.

[49]湯泳萍，周勁松，羅紹春，等. 蘆筍游離小孢子培養(yǎng)研究初報[J]. 江西農業(yè)學報，2011，23（3）：14-16，19.

[50]Davies P A，Morton S. A comparison of barley isolated microspore and anther culture and the influence of cell culture density[J]. Plant Cell Reports，1998，17（3）：206-210.

[51]Bal U，Touraev A. Microspore embryogenesis in selected medicinal and ornamental species of the asteraceae[M]. New York：Springer Science，2009：219-229.endprint