梔子內生真菌的分離與鑒定

林貴兵+高娜+徐萍霞+劉勇+葛菲

摘要：分離純化梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）新鮮果實中的內生真菌，用插片法觀察菌種的菌絲、孢子囊以及孢子等特征，探討梔子內生真菌群落多樣性。結果表明，從梔子果實中分離獲得了42株內生真菌，初步鑒定為1目1科9屬，交鏈孢霉屬（Alternaria spp.）1株，占2.38%；青霉屬（Penicillium spp.）3株，占7.14%；曲霉屬（Aspergillus spp.）3株，占714%；輪枝霉屬（Verticillium spp.）3株，占7.14%；瓶梗青霉屬（Paecilomyces spp.）2株，占4.76%；穗霉屬（Spicaria spp.）2株，占476%；頭孢霉屬（Cephalosporium spp.）1株，占2.38%；粘帚霉屬（Gliocladium spp.）1株，占2.38%；雙曲孢霉屬（Nakataea spp.）26株，占61.9%。其中雙曲孢霉屬為優勢菌群。

關鍵詞：梔子；內生真菌；分離；鑒定

中圖分類號： S567.1+90.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0298-03

收稿日期：2013-07-18

基金項目：江西省教育廳科技計劃（編號：GJJ12537）；江西中醫藥大學博士啟動基金；江西中醫藥大學重點學科青年教師扶持項目。

作者簡介：林貴兵（1981—），男，四川自貢人，博士，講師，主要從事中藥資源研究。E-mail：linguibing897@gmail.com。梔子為茜草科梔子屬植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）干燥成熟的果實，是一種常見的中藥，也是江西省道地藥材之一，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血消毒等功效，外敷可治扭傷瘀腫，主要用于治療黃疸型傳染性肝炎、膽囊炎等癥。梔子主要生于海拔1 000 m以下的低坡紅壤土地，不耐寒[1]。目前關于梔子的研究主要集中在地理環境、氣候條件、采收期不同對梔子藥材品質的影響方面[2～6]，梔子內生菌群對其品質的影響研究還未見報道。可以采用組織學方法、嚴格進行表面消毒的植物組織塊分離方法，以及植物組織直接擴增微生物DNA方法來證明內生菌的內生性[7]。內生菌群可以通過產生生長素、增進宿主植物營養元素吸收來促進宿主生長，增強宿主抗旱、抗高溫、抗蟲害等抗逆性，部分內生真菌能夠促進藥用植物次生代謝產物的合成，產生與宿主相同或相似的藥用活性成分[8]。本研究分離純化梔子新鮮果實中的內生真菌，用插片法觀察菌種的菌絲、孢子囊以及孢子等特征，探討梔子內生真菌群落的多樣性。

1材料與方法

1.1材料

2012年10月采自江西中醫藥大學神農園藥用植物梔子的新鮮果實，經劉勇副教授鑒定為茜草科梔子屬植物梔子。江西省南昌市屬中亞熱帶濕潤季風氣候，氣候濕潤溫和，日照充足，年均氣溫17.0～17.7 ℃，年均降水量1 600～1 700 mm，年均相對濕度為78.5%。

1.2方法

1.2.1內生真菌的分離采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）與混合抗生素（80萬單位青霉素鈉與硫酸慶大青霉素注射液4萬單位混合溶解）培養分離梔子果實的內生真菌。將新鮮健康的梔子果實用自來水沖洗干凈，再用無菌水洗 2～3次，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡 1 min，再用75%乙醇處理5 min，對果實表面進行消毒，再用無菌水沖洗4～5次。削去外皮，取少量果肉置于培養基中，28 ℃ 下恒溫培養 7～10 d。待組織塊周圍長出白色菌絲后，用接種針挑起，純化菌種。

1.2.2內生真菌鑒定將菌種置于PDA培養基中，采用插片法在28 ℃下恒溫培養7～10 d，觀察其產孢結構、分生孢子梗著生情況、孢子形態與顏色，參考《真菌鑒定手冊》[9]鑒定內生真菌。

2結果與分析

2.1內生真菌種群

2.1.1交鏈孢霉屬（Alternaria spp.）菌落生長迅速，初期為黑色，隨后有灰白色棉絮狀菌生長，背面灰黑色。營養菌絲有分隔。分生孢子梗暗色，通常較短，單生或分枝簡單，直或略彎曲，有隔。分生孢子暗色，橫隔1～6個，縱隔0～5個，倒棍棒形、橢圓形或卵形，頂端常延長為喙狀，經常向頂著生成鏈（圖1）。

2.1.2青霉屬（Penicillium spp.）菌落灰色或灰白色，絨毛狀、蛛網狀或棉絮狀，背面黑色，菌絲有隔。分生孢子梗從菌絲中垂直生出，無足細胞，暗色，有橫隔膜，菌絲單個發生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，單胞，褐色，球形或卵圓形 （圖2）。

2.1.3曲霉屬（Aspergillus spp.）菌落為褐色或黃色顆粒狀， 背面黃色或棕色。菌絲無色、淡色或表面凝集有色物質，有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細胞（足細胞）中垂直生出，大多數無隔膜，光滑或粗糙，上部較粗大，頂端膨大成球形、橢圓形、半圓形或棍棒形的泡囊，從泡囊的表面以放射狀生出小梗或僅在泡囊頂部產生小梗，小梗單層或在頂部再分枝成2個或多個小梗。分生孢子串生于小梗頂端，呈輻射狀排列或叢集成柱形，著色、形狀、大小、紋飾變化很大（圖3）。

2.1.4輪枝霉屬（Verticillium spp.）菌落生長早期呈灰色，絨毛狀，周圍有褐色顆粒物長出，后期有白色棉絮狀菌長出，背面接種處黑色，周圍淺黃色。或菌落生長早期呈灰色，后漸暗，棉絮狀，背面黑色。分生孢子梗細長，輪生分枝。分生孢子為梗孢子，卵圓形或橢圓形，褐色，單胞，單生或頂生成小的潮濕簇，成向基的鏈（圖4）。

2.1.5瓶梗青霉屬（Paecilomyces spp.）菌落生長早期呈灰綠色，凝聚灰綠色粉狀物質，后有灰白色棉絮狀菌長出。或菌落暗灰色，棉絮狀，背面黑色，菌絲有隔。分生孢子梗從菌絲中垂直生出，無足細胞，暗色，有橫隔膜，菌絲單個發生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，單胞，褐色，球形或卵圓形，成向基的鏈，有2種形態（圖5）。endprint