梔子內(nèi)生真菌的分離與鑒定

林貴兵+高娜+徐萍霞+劉勇+葛菲

摘要：分離純化梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）新鮮果實(shí)中的內(nèi)生真菌，用插片法觀察菌種的菌絲、孢子囊以及孢子等特征，探討梔子內(nèi)生真菌群落多樣性。結(jié)果表明，從梔子果實(shí)中分離獲得了42株內(nèi)生真菌，初步鑒定為1目1科9屬，交鏈孢霉屬（Alternaria spp.）1株，占2.38%；青霉屬（Penicillium spp.）3株，占7.14%；曲霉屬（Aspergillus spp.）3株，占714%；輪枝霉屬（Verticillium spp.）3株，占7.14%；瓶梗青霉屬（Paecilomyces spp.）2株，占4.76%；穗霉屬（Spicaria spp.）2株，占476%；頭孢霉屬（Cephalosporium spp.）1株，占2.38%；粘帚霉屬（Gliocladium spp.）1株，占2.38%；雙曲孢霉屬（Nakataea spp.）26株，占61.9%。其中雙曲孢霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群。

關(guān)鍵詞：梔子；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.1+90.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0298-03

收稿日期：2013-07-18

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科技計(jì)劃（編號(hào)：GJJ12537）；江西中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)基金；江西中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科青年教師扶持項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：林貴兵（1981—），男，四川自貢人，博士，講師，主要從事中藥資源研究。E-mail：linguibing897@gmail.com。梔子為茜草科梔子屬植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）干燥成熟的果實(shí)，是一種常見(jiàn)的中藥，也是江西省道地藥材之一，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血消毒等功效，外敷可治扭傷瘀腫，主要用于治療黃疸型傳染性肝炎、膽囊炎等癥。梔子主要生于海拔1 000 m以下的低坡紅壤土地，不耐寒[1]。目前關(guān)于梔子的研究主要集中在地理環(huán)境、氣候條件、采收期不同對(duì)梔子藥材品質(zhì)的影響方面[2～6]，梔子內(nèi)生菌群對(duì)其品質(zhì)的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道。可以采用組織學(xué)方法、嚴(yán)格進(jìn)行表面消毒的植物組織塊分離方法，以及植物組織直接擴(kuò)增微生物DNA方法來(lái)證明內(nèi)生菌的內(nèi)生性[7]。內(nèi)生菌群可以通過(guò)產(chǎn)生生長(zhǎng)素、增進(jìn)宿主植物營(yíng)養(yǎng)元素吸收來(lái)促進(jìn)宿主生長(zhǎng)，增強(qiáng)宿主抗旱、抗高溫、抗蟲(chóng)害等抗逆性，部分內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成，產(chǎn)生與宿主相同或相似的藥用活性成分[8]。本研究分離純化梔子新鮮果實(shí)中的內(nèi)生真菌，用插片法觀察菌種的菌絲、孢子囊以及孢子等特征，探討梔子內(nèi)生真菌群落的多樣性。

1材料與方法

1.1材料

2012年10月采自江西中醫(yī)藥大學(xué)神農(nóng)園藥用植物梔子的新鮮果實(shí)，經(jīng)劉勇副教授鑒定為茜草科梔子屬植物梔子。江西省南昌市屬中亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，氣候濕潤(rùn)溫和，日照充足，年均氣溫17.0～17.7 ℃，年均降水量1 600～1 700 mm，年均相對(duì)濕度為78.5%。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）與混合抗生素（80萬(wàn)單位青霉素鈉與硫酸慶大青霉素注射液4萬(wàn)單位混合溶解）培養(yǎng)分離梔子果實(shí)的內(nèi)生真菌。將新鮮健康的梔子果實(shí)用自來(lái)水沖洗干凈，再用無(wú)菌水洗 2～3次，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡 1 min，再用75%乙醇處理5 min，對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，再用無(wú)菌水沖洗4～5次。削去外皮，取少量果肉置于培養(yǎng)基中，28 ℃ 下恒溫培養(yǎng) 7～10 d。待組織塊周?chē)L(zhǎng)出白色菌絲后，用接種針挑起，純化菌種。

1.2.2內(nèi)生真菌鑒定將菌種置于PDA培養(yǎng)基中，采用插片法在28 ℃下恒溫培養(yǎng)7～10 d，觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況、孢子形態(tài)與顏色，參考《真菌鑒定手冊(cè)》[9]鑒定內(nèi)生真菌。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌種群

2.1.1交鏈孢霉屬（Alternaria spp.）菌落生長(zhǎng)迅速，初期為黑色，隨后有灰白色棉絮狀菌生長(zhǎng)，背面灰黑色。營(yíng)養(yǎng)菌絲有分隔。分生孢子梗暗色，通常較短，單生或分枝簡(jiǎn)單，直或略彎曲，有隔。分生孢子暗色，橫隔1～6個(gè)，縱隔0～5個(gè)，倒棍棒形、橢圓形或卵形，頂端常延長(zhǎng)為喙?fàn)睿?jīng)常向頂著生成鏈（圖1）。

2.1.2青霉屬（Penicillium spp.）菌落灰色或灰白色，絨毛狀、蛛網(wǎng)狀或棉絮狀，背面黑色，菌絲有隔。分生孢子梗從菌絲中垂直生出，無(wú)足細(xì)胞，暗色，有橫隔膜，菌絲單個(gè)發(fā)生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，單胞，褐色，球形或卵圓形 （圖2）。

2.1.3曲霉屬（Aspergillus spp.）菌落為褐色或黃色顆粒狀， 背面黃色或棕色。菌絲無(wú)色、淡色或表面凝集有色物質(zhì)，有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細(xì)胞（足細(xì)胞）中垂直生出，大多數(shù)無(wú)隔膜，光滑或粗糙，上部較粗大，頂端膨大成球形、橢圓形、半圓形或棍棒形的泡囊，從泡囊的表面以放射狀生出小梗或僅在泡囊頂部產(chǎn)生小梗，小梗單層或在頂部再分枝成2個(gè)或多個(gè)小梗。分生孢子串生于小梗頂端，呈輻射狀排列或叢集成柱形，著色、形狀、大小、紋飾變化很大（圖3）。

2.1.4輪枝霉屬（Verticillium spp.）菌落生長(zhǎng)早期呈灰色，絨毛狀，周?chē)泻稚w粒物長(zhǎng)出，后期有白色棉絮狀菌長(zhǎng)出，背面接種處黑色，周?chē)鷾\黃色。或菌落生長(zhǎng)早期呈灰色，后漸暗，棉絮狀，背面黑色。分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，輪生分枝。分生孢子為梗孢子，卵圓形或橢圓形，褐色，單胞，單生或頂生成小的潮濕簇，成向基的鏈（圖4）。

2.1.5瓶梗青霉屬（Paecilomyces spp.）菌落生長(zhǎng)早期呈灰綠色，凝聚灰綠色粉狀物質(zhì)，后有灰白色棉絮狀菌長(zhǎng)出。或菌落暗灰色，棉絮狀，背面黑色，菌絲有隔。分生孢子梗從菌絲中垂直生出，無(wú)足細(xì)胞，暗色，有橫隔膜，菌絲單個(gè)發(fā)生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，單胞，褐色，球形或卵圓形，成向基的鏈，有2種形態(tài)（圖5）。endprint