DNA指紋數據庫在我國主要農作物種質資源中的應用

孔維國　王俊峰　丁漢鳳

摘 要：農作物種質資源是國家重要戰略資源之一。我國的農作物種質資源豐富并有著獨特的地域性，農作物種質資源的DNA指紋數據庫不僅在種子質量和專利權保護方面發揮著重要作用，在種質品種鑒定、農作物育種和農作物遺傳作圖等方面也起著積極作用。因此，構建我國農作物DNA指紋數據庫對保護我國豐富的種質和基因資源有著長遠意義。

關鍵詞：DNA指紋數據庫；農作物；種質資源；分子標記

中圖分類號：S325 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0131-05

農作物種質資源是保障農業生產穩定的基礎，也是人類未來生存和發展的先決條件，其在農業科學和生命科學研究領域中占有極為重要的地位[1]。目前，由于分子生物學特別是轉基因技術在育種方面的應用，使種質資源展現了親本利用的集中化和核心化趨勢，出現了大量在形態上相似而只存在個別性狀或基因差異的品種，傳統形態學方法已無法進行準確的品種鑒定和純度分析，加大了種質資源收集、整理、鑒定及品種選育的難度[2]。另一方面，目前國內種子市場存在部分以劣充優、以假亂真的現象，嚴重影響了優良品種的增產效益，給育種者和農業經濟造成了巨大的損失[3]。因此，尋找一種安全有效、方便快捷、精確穩定的技術以鑒定種質資源的真實性和純度顯得尤為重要。近年來，我國政府高度重視作物種質資源信息系統的研究，在連續6個五年計劃中，國家科技攻關項目均設立了專題研究，并取得重要進展。

1 DNA指紋數據庫起源

隨著現代分子生物學技術和電泳技術的迅猛發展，一種新的分子標記技術——電泳指紋圖譜技術在農作物種質資源的親緣關系鑒定、品種審定和雜優類群劃分等方面發揮了很大的作用[4]。電泳指紋圖譜技術分為蛋白質指紋圖譜和DNA指紋圖譜，較之前者，后者不受環境、生物發育時期、組織器官及基因表達等影響，遺傳穩定、多態性高，且不影響目標性狀的表現，因此更具優勢，目前已被廣泛用于農作物種質資源的鑒定[3]。DNA指紋圖譜多態性豐富且具有高度的個體特異性和環境穩定性，它提供的是可見的條碼式譜帶圖譜，可通過計算機進行系統管理，而由此構建的數據庫就被稱為DNA指紋數據庫。2005年，國際植物品種權保護組織（UPOV）擬定的BMT測試指南草案中規定，將微衛星（Microsatellite），亦稱簡單序列重復（Simple Sequence Repeats， SSR）和單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms， SNP）等分子標記技術確定為構建DNA指紋數據庫的標記方法。

2 我國農作物種質資源DNA指紋數據庫的構建

建立DNA指紋數據庫一般需要如下幾個關鍵性因素：標記方法和標記來源，嚴格規范的檢測平臺，核心樣品的選定，核心引物的選定，數據的整合和數據庫的評估[5，6]。目前國內DNA指紋數據庫的標記方法和來源一般是參照國際上的通用標準——SSR標記方法，個別的采用非主流方法和標準[7～9]。檢測平臺則因各個科研單位人員、技術和資金等因素的限制而有所不同，一般為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，個別資金充裕的單位采用毛細管電泳[5]。核心樣品的選用因各地的研究方向不同而各有側重[10，11]。核心引物的選用比較多樣化，由于核心引物的選擇不同，導致各個數據庫在整合方面出現了一定的難度，這可能成為今后工作的重點之一。近年，我國已在小麥、玉米、水稻、大豆、花生、棉花等多個物種開展DNA指紋數據庫的構建，并取得了重要進展。

2.1 小麥DNA指紋數據庫構建

由于小麥基因組巨大，目前國際上該方面的研究主要停留在通過分子標記的方法對小麥的物理圖譜進行測定，其大范圍的物理圖譜測定工作已基本完成[12]。我國在該方面的研究也進展迅速。1999～2000年，高睦槍等利用53對SSR標記對北方冬麥區及黃淮冬麥區觀察譜中選出的48個新品種（系）進行了遺傳差異研究，發現利用5個多態性高的SSR標記可以將48個小麥新品種（系）鑒定開[7]。2006年，中國農業科學院作物科學研究所聯合國際玉米小麥改良中心（CIMMYT）、國際干旱地區農業研究中心（ICARDA）和法國Agropolis研究所， 建立了包括134個SSR引物、 2 457個普通小麥基因型的指紋數據庫[13]。2007年，王立新等采用15個SSR標記和20個AFLP-SCAR標記分析了來自我國不同麥區的455個小麥品種，證明用兩種分子標記建立小麥DNA指紋可以更加全面地反應品種的遺傳多樣性，建立了構建DNA指紋的方法模式[8]。2013年，李莉等以山東省41份小麥種質資源為材料，使用46對SSR引物，構建了DNA指紋數據庫[14]。

2.2 玉米DNA指紋數據庫構建

國際上對玉米DNA指紋數據庫的研究已取得了重要進展，其物理圖譜已經覆蓋了93.5%的玉米基因組[15]。而我國的玉米DNA指紋數據庫的平臺業已基本完成。2006年，北京市農林科學院玉米研究中心聯合國內十多家科研單位開展了中國玉米品種DNA指紋庫構建的研究工作，為了保證玉米品種DNA指紋庫構建的標準化，從建庫標記、檢測平臺、試劑、樣品、評估程序、數據整合、模式庫、擴展庫和隨機盲測9個方面進行了全面的規范，從而為科研單位合作開展大規模的DNA指紋庫構建研究奠定基礎[5]。2007年，王鳳格等用玉米的10對核心引物對1 360份玉米品種進行建庫工作，其中雜交種1 250份，包括本單位自育品種17 份、征集已知品種330份、國家區試及省區試品種855份、植物品種權保護品種48份[6]。2009年，郭長奎等通過4對核心引物對新疆8個主要玉米雜交種及其親本的ISSR分析， 初步構建了新疆玉米DNA特異性指紋圖譜，并建立了數字化特異性指紋數據庫[9]。玉米DNA指紋數據庫的構建是一個復雜的系統工程，為了保證數據庫的標準化，需要建立起一套原則和規范。2010年，北京市農林科學院玉米研究中心經過3 年的開發研究，初步構建了我國玉米DNA指紋數據庫管理系統（http：//www.maizeDNA.com），該系統具有數據管理、數據瀏覽和數據分析3 部分功能，通過將品種的基本信息、形態數據和圖片、DNA指紋數據和指紋圖譜等各種信息匯總起來，建立強大的聯合查詢系統[16]。endprint

2.3 水稻DNA指紋數據庫構建

目前國際上比較流行的是基于BAC文庫方法對水稻物理圖譜進行研究，并在各個文庫間進行比對[17]。由于我國擁有比較豐富的水稻種質資源，目前正處于對各種種質資源進行調查和整理的階段。2009年，陳英華等從500對SSR引物中篩選出10對核心引物， 用于構建東北地區近兩年區域試驗水稻品種的DNA 指紋圖譜，并在100對多態性位點上檢測到300個等位基因[10]。2009年，三明市農業科學研究所的馬紅勃等以福建省三明市農科所選育、福建六三種業有限責任公司經營的24 份雜交稻品種和18份雜交稻親本為材料， 依據中國水稻研究所推薦的12個SSR標記， 建立DNA指紋圖譜[11]。2009年，中國水稻研究所的程本義等，利用前期研究建立的一套水稻品種DNA指紋檢測技術體系，對2002～2006年浙江省主要的98個水稻品種以及2007～2008年155個浙江省區試水稻品種（181個次，含26個續試品種）進行了DNA指紋檢測，構建了279個次水稻品種×12個微衛星標記的DNA指紋圖譜數據庫[18]。2010年，貴州大學馬琳等，從145 對SSR引物中篩選出21對引物，對24份貴州地方水稻品種“禾”品種進行遺傳多樣性分析， 初步建立其DNA指紋圖譜，并通過聚類分析將所有材料分為5 類， 聚類結果表明品種間的親緣關系與地理來源關系不大[19]。

2.4 大豆和花生DNA指紋數據庫構建

大豆DNA指紋數據庫的構建在國際上一直都是熱點，近年來出現了同時應用多種分子標記手段（SSR、RFLP、AFLP和STS）以完成其遺傳連鎖群測定的現象[20]。國內許多研究人員也通過不同分子標記手段在該方面取得一定進展。2001年，田清震等利用Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切篩選適宜大豆AFLP指紋分析的引物組合，并利用17對引物組合建立了我國 92份代表性野生大豆和栽培大豆的AFLP指紋圖譜[21]。2003年，關榮霞等以遺75-14、中黃14、中品662 和中品661共4個品種為試驗材料， 利用不同連鎖群上的SSR引物隨機選擇個體進行分析， 以確定分析品種純度所需的引物數， 為大豆品種資源保存及品種指紋圖譜建立提供理論依據[22]。2007年，王玉民等對大豆屬Glycine亞屬19份多年生野生大豆、Soja亞屬2份野生大豆和2份栽培大豆進行了ISSR分析，構建了栽培大豆和野生大豆的比較指紋圖譜[23]。

花生屬于豆科類作物，但其遺傳多樣性相對較低，這一特征在一定程度上限制了該物種的育種工作。Holbrook于1993年建立了一個包含831個美國花生地方品種組成的核心種質資源庫[24]。而國內的研究現階段還處于花生SSR分子標記的開發階段，在DNA指紋圖譜的構建上有一定的應用。目前已經有800多個花生基因組SSR分子標記。2006年，仲愷農業工程學院的劉冠明等利用20個南方花生品種為材料，從64對SSR引物中篩選出4對構建DNA指紋圖譜[25]。2007年，周桂元等選用110對SSR引物對21個花生變異株系進行SSR多態性分析，有5對引物在變異株系與對照品種之間表現出多態性[26]。2008年，姜慧芳等以中國花生種質資源數據庫中記錄的6 390份花生資源為材料，以其基本數據、特征數據和評價數據為信息，采用分層分組聚類以及隨機取樣與必選資源相結合的方法，構建了由298份資源組成的花生小核心種質，為進一步的DNA指紋數據庫的構建奠定了基礎[27]。

2.5 棉花DNA指紋數據庫構建

國外對棉花DNA指紋圖譜的研究也取得一定的突破，部分染色體指紋圖譜構建已基本完成[22]。國內研究人員以前的工作主要停留在初級階段，利用SSR引物對棉花栽培品種的親本進行多態性分析，以篩選并通過標記區分各個品種或鑒定其純度。2003年，劉勤紅等篩選了217 對異源四倍體棉花的SSR 引物， 獲得了十幾個足以區分魯棉研15 號父母本及其F1的標記位點， 為魯棉研15號雜交種的純度鑒定提供了一個準確、穩定和快捷、實用的方法[28]。隨著研究的深入，研究人員逐漸開始構建DNA指紋數據庫。2005年，秦利等從10對引物中隨機挑選出3對引物對當前新疆主栽品種進行指紋圖譜構建和雜交種純度鑒定，3個標記可分別將3個雜交種與它們的親本加以區分[29]。2009年，中國農業科學院棉花研究所以18份陸地棉和3份海島棉品種為材料， 從78對棉花SSR引物中篩選出55 對具有多態性的引物， 并確定了33對棉種鑒定用的備選核心引物，構建了棉花品種DNA 指紋圖譜[30]。2010年，中國農業科學院棉花研究所利用25對核心引物對中棉所48及其親本進行多態性檢測，構建了中棉所48 的數字指紋圖譜[31]。

3 討論

DNA指紋圖譜技術不僅在種質品種鑒定、種子質量和保護專利權上發揮著重要作用，它也被應用到品種的親緣關系劃分、農作物育種和農作物遺傳作圖等方面[32，33]。但是，由于我國農作物DNA指紋圖譜的研究才剛剛起步，國內各個研究機構水平不一，農作物的DNA指紋數據庫構建所采用的技術、標準和軟件等各不相同，同一農作物存在著若干個不同的DNA指紋數據庫，且大多數數據庫間存在不能兼容的現狀[28～31]。這些情況的存在不僅不利于各個數據庫之間的數據交換，造成資源浪費，更為重要的是它使農作物DNA指紋數據庫間沒有了統一標準，造成單個數據庫容量不足、覆蓋率不足、分辨率不足和不穩定等缺點，阻礙農作物DNA指紋數據庫的構建和發展，影響研究人員對農作物分子育種工作的深入研究。目前國內僅有少數農作物形成統一標準，如中國水稻研究所國家水稻數據中心（http：//www.ricedata.cn）公布的水稻分子標記的信息和技術標準、我國玉米DNA 指紋數據庫管理系統（http：//www.maizeDNA.com），而大多數研究仍是采取國際上的權威數據庫。在數據庫整合過程中，指紋圖譜識別軟件設計與開發滯后也是阻礙農作物DNA指紋數據庫快速發展的重要原因之一，造成農作物DNA指紋數據庫構建的半自動化，影響其構建速度和效率。由于我國農作物種質資源的獨特性，同時也是為了保護我國豐富的種質和基因資源，構建自己的農作物DNA指紋數據庫已迫在眉睫。因此，構建農作物DNA指紋數據庫的基本平臺、統一技術標準、加快相關軟件開發已成為我國近期在該方面工作研究的重點，對于實現農作物DNA指紋數據庫的標準化、自動化和數字化有著重要意義。endprint

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