桑葉中黃酮及1—脫氧野尻霉素的含量影響因素與檢測方法

顧寅鈺等

摘 要：

黃酮是具有2-苯基色原酮結構的化合物，1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）是哌啶類多羥基生物堿，二者均為桑葉的主要有效成分，因其資源豐富、功效顯著，近年來備受關注。本文綜述了影響桑葉中黃酮與1-DNJ含量的因素及其檢測方法。

關鍵詞：桑葉；黃酮；1-DNJ；含量；檢測方法

中圖分類號：S888.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0140-06

桑葉，為桑科植物桑（ Morus alba L.） 的葉。味苦、甘，性寒，歸肺、肝經，具有疏風散熱、清肺潤燥、清肝明目的功能，是一種常用中藥[1]。桑葉的主要有效成分有黃酮類、生物堿、植物甾醇、γ-氨基丁酸、桑葉多糖等，其中研究最多的是黃酮和1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）。本文綜述了桑葉中黃酮和1-DNJ含量的影響因素及其檢測方法。

1 黃酮類化合物

黃酮類化合物（flavonoids）是一類存在于自然界的具有2-苯基色原酮（flavone）結構的化合物。它們分子中有一個酮式羰基，第一位上的氧原子具有堿性，能與強酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結合成苷類，小部分以游離態（苷元）的形式存在。絕大多數植物體內都含有黃酮類化合物，它在植物的生長、發育、開花、結果以及抗菌防病等方面起著重要作用。

桑葉黃酮類成分主要包括蘆丁、槲皮素、異槲皮素和二氫山萘等，占桑葉干重的1%～3%。桑是植物界莖葉黃酮含量較高的一類植物。Kim[2]從桑葉中分離到9種黃酮類成分；Kayo[3]從桑葉的丁醇提取物中也分離到9種黃酮類化合物，其中蕓香苷的含量最高；張雁冰等[4]從馬桑葉的乙醇提取物中分離到山奈酚、槲皮素等9種黃酮類化合物；楊燕等[5]從長穗桑的乙醇提取物中分離到3種黃酮類化合物；劉利等[6]從桑葉中提取、分離、鑒定了3種黃酮類化合物。

1.1 含量影響因素

桑葉中黃酮的含量與桑品種、產地、季節以及葉位等都有顯著相關性。

1.1.1 品種 劉利等[7]研究表明，長穗桑、華桑葉片總黃酮含量分別為63.92、61.17 mg/g，極顯著高于其它桑種，白桑則極顯著低于其它桑種。郭小補等[8]的試驗結果表明，總黃酮含量最高的品種是粵誘33，質量分數為3.92%，最低的是云桑一號，僅為0.76%。劉春蓮等[9]研究發現，桐鄉青的黃酮平均含量最高， 新一之瀨次之， 湖桑32最低。

張軍等[13]報道顯示，湖桑9001的蘆丁含量是湖桑32的2倍，是白桑、雞桑、廣東桑的4倍；而槲皮素的含量則是湖桑32最高，雞桑最低。吳好好等[16]發現，湖桑197、農桑14號、盛東1號的綠原酸較高，果桑大10的蘆丁含量較高，湖桑197、盛東1號的異槲皮苷較高，果桑大10的蘆丁含量大于異槲皮苷，而其他品種則是異槲皮苷高于蘆丁。馬合木提·買買提明等[27]研究表明，新疆藥桑葉蘆丁和異槲皮苷的含量較高，槲皮素的含量較低，蘆丁和異槲皮苷的含量是槲皮素含量的3倍。

1.1.2 產地 張如松等[10]檢測了9個產地的桑葉，其中以臨安產的桑葉中黃酮類成分含量最高， 嘉興的最低。穆春旭等[11]的試驗結果顯示，各產地的桑葉黃酮含量由高到低依次為山東、遼寧、河南、浙江、重慶。孟磊等[12]的結果表明，新疆吐魯番地區的桑葉黃酮含量最高，其次是和田的黑桑，阿克蘇地區的含量最低。

1.1.3 季節 多數人認為冬季桑葉的黃酮含量較高，這也是中藥采用霜桑葉的原因之一。孫敏耀等[15]發現，9月份采收的桑葉黃酮含量最高，7月份最低。徐健飛等[14]的結果表明，桑樹生長前期黃酮含量較低，桑樹停止生長后到晚秋后的這段時間較高。張軍等[13]研究發現，同一產地桑葉中的蘆丁和槲皮素以6月份采摘的含量較低，10月份達到最高。吳好好等[16]研究發現，綠原酸在冬季桑葉中明顯高于春夏秋，而蘆丁和異槲皮素則是冬季高于春季或與之持平并大大超過夏秋季。

1.1.4 葉位 楊普香等[17]的結果表明，桑葉黃酮類化合物含量隨葉位的降低或葉質的變老而逐步減少，桑芽中的含量介于1～3位葉與4～6位葉之間。劉春蓮等[9]發現，桑樹嫩頭的黃酮類化合物含量較高，下部葉片較少。

另外，黃酮種類不同，其隨品種、產地、季節與葉位變化的規律也不同。

1.2 含量檢測方法

1.2.1 分光光度法 分光光度法是目前應用較普遍的一種方法，操作簡便，結果可靠，重復性好。紫外-可見分光光度法是在檢測桑葉黃酮時應用最多的方法，標準品一般采用蘆丁，波長多采用510 nm，樣品提取主要有水提法和醇提法兩種，甲醇與乙醇的提取效率相近[19]。超聲提取明顯優于索氏提取與水煮提取[18]，以70%乙醇超聲提取45 min效果最好[20]，但70%乙醇超聲提取 60 min的含量最高[11]。

熒光分光光度法操作簡便、快速、準確，靈敏度高。一般以蘆丁為標準品，乙醇作溶劑，緩沖液為醋酸-醋酸鈉。王艷[21]報道，其激發和發射波長分別為436 nm和483 nm；而阿布都許庫爾·吐爾遜等 [22]則認為，激發波長297 nm、發射波長432 nm較佳。

1.2.2 高效液相色譜法（HPLC） 近年來，高效液相色譜法（HPLC）逐漸被運用到桑葉黃酮及其苷類化合物的檢測中。該方法易于操作，有很高的準確度、精密度和很好的重復性、穩定性。目前研究中多采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），色譜柱多選擇C18柱，檢測波長為360 nm左右。艾國民等[23]以乙腈-水為流動相，槲皮素為標準品；劉麗芳等[24]以蘆丁、槲皮素為標準品，采用甲醇-0.5%磷酸溶液梯度洗脫；吳好好等[16]以綠原酸、蘆丁、異槲皮苷為標準品，用90%乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫；吳秋生等[25]以蘆丁、槲皮素為標準品，流動相分別采用四氫呋喃-磷酸和乙腈-醋酸緩沖液。endprint

1.2.3 高效毛細管電泳法（HPCE） 該技術是一種高效分離分析技術，具有靈敏度高、柱效高、分析速度快、所需樣品量少、溶劑消耗少和抗污染能力強等優點。檢測波長多為245 nm，緩沖液可采用磷酸二氫鈉-硼砂溶液[26]、Na2B4O7溶液[27]、含有15%甲醇的磷酸二氫鈉-硼砂溶液等[28]。

在以上方法中，分光光度法因其操作簡單且儀器較為普及而倍受歡迎。

2 1-DNJ

1-脫氧野尻霉素（ 1-deoxynojirimycin，1-DNJ） 是存在于桑樹等植物和微生物中的一種多羥基哌啶生物堿，也是桑葉生物堿中研究最多的一種，是一種極性含N化合物，化學名稱是3， 4， 5-三羥基-2-羥甲基四氫哌啶，分子式為C6H13NO4，相對分子質量為163.17。1-DNJ 具有與α-1， 4-葡萄糖類似的結構，是α-葡糖苷酶抑制劑，具有降血糖功能，此外還具有抗腫瘤及抗病毒活性，因此引起國內外學者的普遍關注。

1976年Yagi等[29]首次從市售桑白皮即桑根皮中分離到天然DNJ， 并定名為“moranoline” （mp 204～205℃，C6H13NO4），同時從新鮮的桑根、葉、皮等部位也能分離到，結構為（2R， 3R， 4R， 5S） -2-hydroxymethyl-3， 4， 5-trihydroxypiperidine）。日本學者Asano等[30]從桑葉中分離出多種多羥基生物堿，包括1-DNJ。至今科學家們已陸續從桑樹的各生長部位分離發現了一系列DNJ及其衍生物。

2.1 含量影響因素

桑葉中的1-DNJ含量是隨著桑品種、產地、季節、葉位以及環境條件不同而變化的。由于1-DNJ是桑葉的主要有效成分之一，因此，近年來有很多學者致力于1-DNJ含量影響因素的研究。

2.1.1 品種 李有貴等[31]測定了云南省不同地區的 59 份野生桑葉，其中來自開遠地區的巖桑1-DNJ含量高達 0.7911%。劉凡等[32] 檢測了98 份桑樹品種資源，結果表明4 個桑種間以及多倍體和二倍體桑樹品種間沒有顯著差異，但不同品種間差異明顯，其中白桑種的育 7803含量最高，為1.54 mg/g，另外廣東桑種的黑皮桑、抗銹 2 和白桑種的阿2桑葉中1-DNJ 含量也較高。李化秀等[33]選取山東省內有代表性的17個桑品種進行1-DNJ檢測，桑屬不同種間與不同桑品種間均存在顯著性差異，其中白桑最高，晉選6號和秋雨分別是魯桑和白桑中含量最高的品種，分別為0.227%和0.3281%。

2.1.2 產地 孟夏等[34]試驗表明，不同產地1-DNJ含量差異較大， 其中海南的瓊41和陜西的豬桑含量最高， 分別為0.344%和0.309%；而江蘇的湖桑32號和新疆的疏勒白桑含量較少。魯戰會等[35]研究了全國9個蠶桑主產省區不同產地樣品25份， 結果最高的為陜西漢中， 其次為江西宜春、 廣西合浦和山東濰坊，未發現與產地的關聯性。

2.1.3 季節 楊兵[36]和歐陽臻[37]等都認為4 月份1-DNJ含量較低，5 月份開始增高，到 7、8 月份含量最高，9、10 月份又降低，11 月份霜后的含量也變低，推測桑葉中 1-DNJ 含量可能與溫度有關。關麗萍等[38]卻認為在秋季采集的桑葉中1-DNJ含量較高。葉晶晶等[39]則認為，嫩芽和嫩葉中的含量以晚秋最高， 成熟葉中以夏季最高， 而老葉中的含量以春季最高。此外， 不同發育階段桑葉中含量的變化幅度以春季最小， 晚秋變化最大。

2.1.4 葉位 同一季節不同發育時期的1-DNJ含量均隨葉位由高到低遞減，嫩芽>嫩葉>成熟葉>老葉[39]。魏兆軍等[40]的結果也表明，第 1 葉位至第 5 葉位1-DNJ的含量逐漸降低。

2.1.5 環境條件 遮蔭處理能顯著增加桑苗葉片的1-DNJ 含量，在25%光強下處理5 d 時，桑苗葉片中1-DNJ 含量最高，達0.2043%；遮蔭5 d 后繼續遮蔭對桑葉中1-DNJ 含量基本沒有影響[41]。氮磷鉀肥的施肥水平及其配比均能顯著影響桑葉中1-DNJ質量分數，桑葉中總1-DNJ最佳經濟產量為23.23 kg/hm2，推薦施肥指標氮為286.1 kg/hm2，五氧化二磷為95.2 kg/hm2，氧化鉀為159.6 kg/hm2。

與黃酮不同的是，1-DNJ在溫度較高季節、生長較為旺盛時期含量較高，若是側重桑葉在降血糖上的應用應該考慮季節的因素。

2.2 檢測方法

1-DNJ及其衍生物結構中含有較多羥基，屬氮雜糖類，結構中沒有苯環、雙鍵、羰基等發色團，在可見光區和紫外光區都沒有吸收，因此定性定量分析都較困難。

2.2.1 高效液相色譜法（HPLC） 高效液相色譜法是目前1-DNJ檢測中使用較多的方法。一種是不需要進行衍生化，可以借助特殊檢測器直接檢測1-DNJ，如蒸發光散射檢測器（ELSD）、示差折光檢測器、質譜等。ELSD最大的優越性在于能檢測不含發色團的化合物，并在沒有標準品或者化合物結構參數未知的情況下檢測未知化合物，簡便、快捷，重現性好， 靈敏度高。姜永濤[43]、宋婕[44]、陳正收[45]等均采用此法對1-DNJ進行了檢測，色譜柱均采用NH2柱，流動相均為乙腈-水，ELSD漂移管溫度為50℃左右。示差折光檢測器是一種高度穩定和靈敏的色譜檢測器，可用于檢測在紫外光范圍內吸光度弱的化合物。歐陽華學等[47]采用的色譜柱為Zorbax Carbohydrate，流動相為乙腈-水，該方法簡便、快速。高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用（HPLC-MS/MS）選擇性強、靈敏度高。戴開金等[46]以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相， SHIMADZU HRC-NH2柱分離， 質譜條件為：采用大氣壓化學電離源（APCI）， 164.1/146.1、164.1/110.2兩對離子， 多反應監測（MRM）。endprint

另一種是1-DNJ需要進行柱前衍生化反應，然后利用紫外-可見檢測器、熒光檢測器以及二極管陣列檢測器等進行檢測。熒光檢測器具有靈敏度極高、結果更準確、可靠等優點，歐陽臻等[50]用芴甲氧酰氯（FMOC-Cl）與 1-DNJ 反應生成熒光產物，色譜柱為C18分析柱及 ODS3 預柱，流動相為乙腈-0.1% 醋酸，熒光檢測器激發波長254 nm，發射波長322 nm。謝慧明等[51]采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）進行衍生化，激發波長為250 nm、發射波長為395 nm。紫外檢測法雖不及熒光檢測法的靈敏度高，但是由于檢測器相對便宜，一般的高效液相色譜儀均有配備，因此更易于推廣普及。施新琴等[48]用9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC）為衍化劑，在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液中進行衍生化反應，色譜柱為C18柱，檢測波長為254 nm，流動相為乙腈-0.1%醋酸水溶液。張旻[49]則采用2， 4-二硝基氟苯（DNFB）進行衍生化反應，流動相為乙腈-0.1%醋酸甲醇，檢測波長355 nm。二極管陣列檢測器，也稱PDA（photo-diode array）、PDAD（photo-diode array detector）或DAD（diode array detector）。陳正收等[45]采用C18為色譜柱，乙腈-0. 1%醋酸溶液為流動相，檢測波長為265 nm 。

上述檢測器中蒸發光散射檢測器（ELSD）、示差折光檢測器、質譜以及熒光檢測器與紫外檢測器相比，適用范圍相對狹窄、價格相對昂貴，一般高效液相色譜儀上較少配置，故在應用普及方面不及紫外檢測器范圍廣。

2.2.2 氣相色譜法 該法先將1-DNJ乙酰化成沸點較低的酯類，再采用氣相色譜法檢測。該方法操作簡便， 能夠快速、準確檢測出桑葉中的1-DNJ含量。汪孟夏[52]采用色譜柱OV-1701，檢測器溫度310℃，氫氣流量47 mL/min。李宏等[53]則采用色譜柱DB-5，檢測器溫度260℃，氫氣流量60.0 mL/min。

2.2.3 分光光度法 分光光度法被廣泛應用于不同物質的含量測定，1-DNJ本身無紫外-可見光吸收，但與顯色劑碘-碘化鉀混合后，其吸收光譜發生了變化，在334 nm處，一定濃度范圍內，其吸光度與1-DNJ濃度符合Lambert-Beer定律，據此可用分光光度法測定桑葉中1-DNJ含量。楊海霞[54]、黎歡吉[55]等用陽離子交換層析法純化桑葉中的1-DNJ，并采用紫外-可見分光光度計對桑葉中1-DNJ含量進行了測定。胡瑞君等[56]利用微波輔助提取技術提取桑葉中的1-DNJ，采用分光光度法測定 1-DNJ 含量。但由于1-DNJ本身沒有顏色，其它少量色素的存在就可能對溶液的吸光度產生影響，所以較少采用分光光度計檢測。

在以上的檢測方法中，采用較多的是柱前衍生化后經高效液相色譜檢測，檢測器以常用的紫外和熒光檢測器較多。

3 結語

黃酮與1-DNJ是目前桑中研究較多的成分，而能否提供一種快速、準確的測定方法是深入研究的首要條件，因此眾多學者致力于各種檢測方法的研究，以簡便與準確為目標開發新的或改進原有的檢測方法依然是今后的研究方向之一。關于產地對二者的影響方面，由于沒有不同產地種植的同一桑品種黃酮與1-DNJ含量變化規律的報道，所以現有的關于產地的差異性結果，可能直接或間接地受到了品種、溫度以及施肥情況的影響，具有一定的局限性，需要進一步研究。另外，進一步探明黃酮與施肥情況以及光照等環境因素的關系，以及影響桑葉中黃酮、1-DNJ等諸多活性成分含量的主導和非主導因素，都是今后的研究方向，這都將為以后進一步利用桑資源的藥用價值提供理論依據，同時促進蠶桑產業的發展。

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